一株猪源嗜酸乳杆菌体外生长、产酸、抑菌、黏附及抗氧化能力的研究

一株猪源嗜酸乳杆菌体外生长、产酸、抑菌、黏附及抗氧化能
力的研究
赵臣;王四新;张董燕;刘辉;王晶;张伟;魏时来;季海峰
【摘要】[目的]确定一株猪源嗜酸乳杆菌的体外生物学特性.[方法]采用全自动曲线分析仪测定该菌株不同接种量的生产曲线;采用试剂盒法测定了该菌株的产酸力和抗氧化性能;采用琼脂平板扩散法检测了该菌株的抑菌特性;使用猪肠上皮细胞测定了该菌株的黏附性能.[结果]该菌株最适生长接种量为4％;培养60 h时产乳酸量最高,为66.85 mmol/L;对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径均在19mm以上;该菌株具有较好的抗氧化能力;菌悬液浓度为109 CFU/mL时,该菌株对猪肠上皮细胞的黏附指数最高,为1 060 CFU/100 cell.[结论]该菌株具有良好的益生特性.
【期刊名称】《甘肃农业大学学报》
【年(卷),期】2018(053)002
【总页数】7页(P6-12)
【关键词】嗜酸乳杆菌;生物学特性;抗氧化能力
【作者】赵臣;王四新;张董燕;刘辉;王晶;张伟;魏时来;季海峰
【作者单位】甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州730070;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京100097;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京100097;北京市农林科学
院畜牧兽医研究所,北京100097;甘肃农业大学动物科学技术学院,甘肃兰州730070;北京市农林科学院畜牧兽医研究所,北京100097
【正文语种】中文
【中图分类】S182
饲料中抗生素滥用不仅导致病原菌株耐药性增强，而且使动物肠道菌群失衡，影响机体健康和肉食品安全.乳酸菌作为动物肠道中重要的正常生理菌，具有改善肠道环境、平衡肠道菌群、抗氧化、提高免疫力和促进机体生长等作用[1-3]，具有开发绿色高效饲料添加剂的良好前景.嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)是存在于胃肠道的正常乳酸菌，属同型乳酸发酵类型，乳酸为其主要代谢产物，并经代谢产生细菌素等物质，具有降低肠道pH值、抑制病原菌生长、消除活性氧自由基和抗脂质过氧化等功能，益于机体健康和生长[4-7].Qiao等[8]研究表明，嗜酸乳杆菌能提高断奶仔猪生长性能，调节肠道微生物区系和血清中细胞因子的表达.Lan 等[9]研究显示，嗜酸乳杆菌能提高断奶仔猪生长性能、养分消化率，维持肠道菌群平衡，并能减少氨气的释放.Kumar等[10]证明了嗜酸乳杆菌可显著提高新生肠道无菌仔猪能量与脂肪代谢的转录组水平.目前，嗜酸乳杆菌在养殖生产中的作用效果已有报道，但对该菌株的体外益生特性尚无深入研究.本研究拟开展该菌株生长曲线、产酸力、抑菌性、黏附性和抗氧化能力等规律的研究，旨在为该菌株的开发利用准备必要条件.
1 材料与方法
1.1 试验菌种
试验所用猪源嗜酸乳杆菌，由北京市农林科学院畜牧兽医研究所动物营养研究室分离选育，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心鉴定，属嗜酸乳杆菌
(Lactobacillus acidophilus).
试验所用猪大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌，均购于中国兽医药品监察所.
1.2 试剂和仪器
试剂：MRS培养基，乳酸、总抗氧化能力(T-AOC)、丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过
氧化物酶(GSH-PX)和总超氧化物歧化酶(T-SOD)测试盒(购于南京建成生物工程研究所)，MH(A)和MH(B)培养基(购于北京市奥博星生物技术有限责任公司).
仪器：ZHWY-2102型全温震荡培养箱、发恩D-1立式蒸汽灭菌锅、ESCO生物
安全柜、Bioscreen全自动生长曲线分析仪、UV-2800型紫外可见分光光度计、Mettler Toledo pH计.
1.3 试验方法
1.3.1 嗜酸乳杆菌生长曲线测定菌株活化2次后，将菌液按1.0，
2.0，
3.0，
4.0%和
5.0%(V/V)分别接种于已灭菌的MRS液体培养基中，每瓶取接有菌液的MRS
培养基350 μL于Bioscreen全自动生长曲线分析仪蜂窝状专用板中；每组设10
重复，于37 ℃，培养48 h.利用Bioscreen全自动生长曲线分析仪测定D600值，绘制生长曲线.
1.3.2 菌株产酸力测定将菌株活化2次后，接种于MRS液体培养基，37 ℃恒温
培养，每隔12 h测定培养液pH值并取样测定发酵液中乳酸含量.
1.3.3 菌株抑菌性测定采用琼脂平板扩散法测定嗜酸乳杆菌的抑菌能力.将大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌分别在MH(B)培养基中，37 ℃培养18 h，活化2
次后备用.将活化好的的大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌分别涂布于 MH(A)平板中，并放入牛津杯，将嗜酸乳杆菌发酵液加入至牛津杯中，于4 ℃扩散4 h，再于37 ℃培养8～10 h，观察3种致病菌平板中的抑菌圈大小.
1.3.4 菌株抗氧化能力测定
1.3.4.1 试验样品制备发酵上清液制备：将菌株活化2次后，接种于MRS液体培
养基，37 ℃恒温培养20 h，培养液经4 000 r/min，4 ℃离心10 min，收集上
清液即为试验所需发酵上清液.
菌体溶液制备：上述离心所得菌体沉淀，经PBS溶液清洗3次后，重悬于等体积
的PBS溶液中，所得溶液即为试验所需的菌体溶液.
胞内提取物溶液制备：离心所得菌体沉淀，经PBS溶液清洗3次后，冰浴条件下
进行粉碎，然后重悬于等体积的PBS溶液中，于8 000 r/min，4 ℃离心15 min，收集上清液，即为试验所需的胞内提取物溶液.
1.3.4.2 耐H2O2能力测定将活化好的菌液分别接种于含H2O2浓度为0.0，0.5，1.0，1.5，
2.0，2.5，
3.0，3.5，
4.0，
5.0 mmol/L已灭菌的MRS液体培养基中，每瓶取接有菌液的MRS培养基350 μL于Bioscreen全自动生长曲线分析仪蜂窝
状专用板中，每组10个重复，于37 ℃培养48 h.利用Bioscreen全自动生长曲
线分析仪测定D600值，绘制生长曲线.
1.3.4.3 试样T-AOC、T-SOD、GSH-PX和 MDA测定严格按照试剂盒中的操作
说明方法测定发酵上清液、菌体溶液和胞内提取物中的T-AOC、T-SOD、GSH-PX和 MDA含量；MDA测定时，以MRS培养基为对照组.
1.3.5 菌株黏附性能测定嗜酸乳杆菌溶液的制备：将菌株活化后，取适量发酵液离心取菌体，制备含嗜酸乳杆菌浓度分别为106，107，108，109CFU/mL的DMEM溶液.
细胞的培养：选用猪肠上皮细胞，经传代3次，待细胞在培养瓶中生长密度达80%以上时，取适量在24孔培养板中培养，至细胞黏附到培养板底部，备用.
嗜酸乳杆菌黏附性能测定：试验共设5组，分别为A:嗜酸乳杆菌活菌数106
CFU/mL；B:嗜酸乳杆菌活菌数107 CFU/mL；C:嗜酸乳杆菌活菌数108 CFU/mL；D:嗜酸乳杆菌活菌数109 CFU/mL；E：对照组(未添加嗜酸乳杆菌).将制备好的DMEM溶液加入到细胞培养板中，每组3个重复，在CO2培养箱中培养2 h后，
取出，经洗涤，取适量菌液，涂板测定活菌数，对照组计算细胞数.
1.4 统计分析
数据处理与分析采用SPSS 19.0软件的Oneway ANOVA进行单因素分析，均值
的多重比较采用Duncan氏法进行，结果用表示.
2 结果与分析
2.1 猪源嗜酸乳杆菌的生长曲线
以发酵时间为横坐标，D600值为纵坐标绘制菌株不同接种量时的生长曲线(图1).
猪源嗜酸乳杆菌在不同接种量条件下的生长适应期均为0～2 h；接种量为1%时，对数生长期为2～26 h；接种量为2%时，对数生长期为2～22 h；接种量为3%、4%和5%时，对数生长期为2～20 h.之后菌株均进入生长稳定期.在生长稳定期内，接种量为4%时，该菌株D600值高于其他接种量.
图1 不同接种量嗜酸乳杆菌生长曲线Figure 1 Growth curve of Lactobacillus acidophilus with different inoculation quantities
2.2 菌株产酸情况
以培养时间为横坐标，乳酸含量及pH为纵坐标绘制菌株产酸情况变化的趋势图(图2).0，12，24，36，48，60，72 h的pH分别为6.21，4.91，4.26，3.85，3.85，3.84，3.86，培养36 h后pH值趋于稳定；乳酸含量分别为0.91，22.19，44.38，54.74，65.87，66.85，62.54 mmol/L，培养48～60 h时的乳酸含量显著高于其他时间点的乳酸含量.
图2 嗜酸乳杆菌不同培养时间点pH及乳酸含量Figure 2 Lactic acid content and pH in different incubation time of Lactobacillus acidophilus
2.3 菌株抑菌性能
嗜酸乳杆菌抑菌特性见表1和图3.猪源嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、沙门菌和金黄色
葡萄球菌抑菌圈直径分别为19.0，19.5，20.5 mm，抑菌圈直径均在19.0 mm
以上，说明该菌株有较好的抑菌特性.
表1 嗜酸乳杆菌对致病菌的抑菌圈直径Table 1 Diameter of inhibition zone of Lactobacillus acidophilus against pathogenic bacteria mm指标大肠杆菌Escherichia coli沙门菌Salmonella金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus抑菌圈直径19.0±0.1519.5±0.1020.5±0.20
A：大肠杆菌(Escherichia coli)；B：沙门菌(Salmonella)；C：金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus).图3 嗜酸乳杆菌抑菌特性Figure 3 Antimicrobial property of Lactobacillus acidophilus
2.4 菌株抗氧化能力
2.4.1 菌株耐H2O2能力以培养时间为横坐标，D600值为纵坐标，绘制菌株不同H2O2浓度下的生长曲线(图4).随着H2O2浓度的增加，嗜酸乳杆菌的生长适应
期也在增加，表明H2O2能导致菌株氧化损伤；H2O2浓度为4.0，5.0 mmol/L 时，该菌株均未生长，而其他H2O2浓度时菌株正常生长，表明该菌株的最大耐
受H2O2浓度为3.5 mmol/L.
2.4.2 T-AOC、GSH-PX、T-SOD和MDA测定结果由表2可知，嗜酸乳杆菌发
酵上清液、菌体溶液和胞内提取物中的T-AOC分别为33.30，1.30，0.56 U/mL，发酵上清液显著高于菌体溶液和胞内提取物，菌体溶液与胞内提取物之间也存在显著性差异；发酵上清液中GSH-PX和T-SOD分别为24.80，72.56 U/mL，均显著高于菌体溶液和胞内提取物溶液，而菌体溶液与胞内提取物未产生显著性差异. 图4 不同H2O2浓度嗜酸乳杆菌生长曲线Figure 4 Growth curve of Lactobacillus acidophilus with different concentrations of H2O2
由表3可知，嗜酸乳杆菌菌体溶液、胞内提取物、发酵上清液和MRS培养基中MDA含量分别为0.21，0.14，8.63，10.30 nmol/mL，菌体溶液和胞内提取物
中MDA含量显著低于菌株发酵上清液和MRS培养基，发酵上清液中MDA含量
显著低于MRS培养基中MDA含量.
2.5 菌株黏附性能
由图5可知，嗜酸乳杆菌浓度为106，107，108，109 CFU/mL时的黏附指数分别为5，50，200， 1 050 CFU/100 cell，随着嗜酸乳杆菌浓度增高，菌株黏附量也随之增加；嗜酸乳杆菌浓度为109 CFU/mL时，菌株黏附指数最高，为1 050 CFU/100 cell.表明菌株能较好的黏附于猪肠上皮细胞.
表2 T-AOC、GSH-PX和T-SOD酶活力的测定结果Table 2 T-AOC、GSH-PX and T-SOD activities of Lactobacillus acidophilus (U·mL-1)指标发酵上清液菌体溶液胞内提取物T-AOC33.30a±0.251.30b±0.060.56c±0.06GSH-
PX24.80a±0.2016.70b±0.2016.00b±0.20T-
SOD72.56a±4.320.27b±0.071.39b±0.17
同行数据肩标不同小写字母表示差异极显著(P<0.01).
表3 MDA含量测定结果Table 3 The contents of MDA of Lactobacillus acidophilus (nmol·mL-1)指标MRS培养基发酵上清液菌体溶液胞内提取物MDA10.30a±0.158.63b±0.010.21c±0.070.14c±0.01
图5 不同嗜酸乳杆菌浓度的黏附指数Figure 5 Adhesion index of different concentration of Lactobacillus acidophilus
3 讨论
3.1 嗜酸乳杆菌最适接种量
生长曲线反映一种微生物的生长特性，一般分为生长适应期、对数生长期、稳定期和衰亡期4个阶段.生长适应期是菌株对新的生长环境的一个适应阶段；对数生长期是菌株快速生长繁殖的阶段，微生物的活力最强；稳定期菌株活菌浓度最高，稳定期早期为菌株最适收获期；衰亡期活菌数明显下降.本试验对嗜酸乳杆菌不同接种量培养条件下做了生长曲线，结果显示，在接种量为4%时，猪源嗜酸乳杆菌的
生长情况最佳，在培养2 h时进入对数生长期，20 h时进入稳定期，28 h达到最高D600值.余萍[11]对一株嗜酸乳杆菌的最佳培养条件进行了研究，选取4个接种量梯度，分别为2.5%，5.0%，7.5%，10%，于37 ℃培养24 h，平板计数法测定嗜酸乳杆菌菌落数，结果显示，该菌株的最佳接种量为5%.这与本试验的结果稍有不同，原因可能为试验选取梯度不同或不同菌株间的生长特性存在差异.
3.2 产酸力及抑菌特性
酸性环境可激活胃内蛋白酶原，同时还具有较强的杀菌作用.乳酸菌产生的有机酸可以螯合金属离子和改变细菌细胞膜通透性来发挥抗菌作用.另外，有机酸还能降低肠道pH值，抑制沙门菌、大肠杆菌等的有害菌的生长繁殖[12].赵瑞香等[13]对嗜酸乳杆菌的产酸能力进行了研究，结果显示，37 ℃培养36 h时，发酵液pH为3.83～3.91，酸度103.25～108.56°T.本试验中，培养36 h后，发酵液pH=3.85并达到稳定状态，其乳酸含量为54.74 mmol/L，表明本菌株有较好的产酸性能. 赵瑞香等[14]研究证明嗜酸乳杆菌对致病性大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用，抑菌圈直径均在15.0 mm以上.张帆等[15]对嗜酸乳杆菌的抑菌特性作了研究，结果显示，嗜酸乳杆菌对大肠杆菌和沙门菌的抑菌圈直径均在15.0 mm 以上.杜金城[16]和Lin[17]的研究也表明嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、沙门菌等肠道有害菌的生长有较好的抑制作用.本试验中，嗜酸乳杆菌对大肠杆菌、沙门菌和金黄色葡萄球菌抑菌圈直径均在19 mm以上，说明该菌株有较好的抑菌特性.
3.3 抗氧化能力
氧化应激会产生羟自由基、超氧阴离子自由基、H2O2等活性氧分子[18]，作用于机体内的蛋白质、核酸等生物大分子，造成氧化损伤，危害机体健康.而研究证明乳酸菌可以消除这些活性氧分子，发挥抗氧化作用[19-20].
H2O2不仅可以直接氧化损伤机体，而且能转化为高活性的自由基危害机体.Tang 等[21]研究了植物乳杆菌MA2对H2O2的耐受力，结果表明，该菌株对H2O2
有较好耐受性，最高耐受H2O2浓度为2.0 mmol/L.Das等[22]测得植物乳杆菌DM5耐受H2O2浓度为1.0 mmol/L.而本试验中，测得嗜酸乳杆菌的最高耐受
H2O2浓度为3.5 mmol/L，表明该菌株对H2O2有较高的耐受力，具有较好的抗氧化能力.
T-AOC反映整体抗氧化能力，T-SOD能消除超氧阴离子自由基，保护细胞免受损伤，GSH-PX可以促进H2O2消耗分解.刘天祎等[23]测定干酪乳杆菌发酵上清液
和菌体细胞提取物中的T-AOC分别为12.628，4.444 U/mL、 T-SOD分别为21.12，17.96 U/mL，均为发酵上清液显著高于菌体细胞提取物.宋晓辰等[24]研
究了植物乳杆菌的抗氧化活性，结果表明该菌株产生的T-AOC,T-SOD,GSH-PX
均为发酵上清液高于菌体溶液和胞内提取物.姚杰玢等[25]和Tang等[21]的研究也均表明乳酸菌的发酵上清液抗氧化能力均高于菌体溶液和胞内提取物.本试验中，
发酵上清液中T-AOC、GSH-PX和T-SOD分别为33.30，24.80，72.56 U/mL，均显著高于菌体溶液和胞内提取物中含量(P<0.05)，表明该菌株发挥抗氧化能力
的主要部位为发酵上清液，与上述研究结果相同，说明菌株抗氧化的活性物质存在的部位不同且含量有明显差异；嗜酸乳杆菌发酵上清液、菌体溶液和胞内提取物中的T-SOD分别为72.56，0.27，1.39 U/mL，菌体溶液和胞内提取物中活性较低，绝大部分活性表现于发酵上清液，与上述试验结果不同，原因可能为，不同菌株之间抗氧化能力不同，发酵产生抗氧化物质的种类、部位、含量均存在差异，具体原因有待进一步研究.综上表明该菌株具有较好的抗氧化能力，且主要表现于发酵上
清液中.
MDA反映脂质过氧化程度.Lin等[26]研究表明嗜酸乳杆菌具有抗脂质氧化的作用.本试验中，发酵上清液中MDA含量显著低于MRS培养基中MDA含量，表明该菌株有较好的抗脂质氧化作用；而菌体溶液和胞内提取物中MDA含量显著低于发酵上清液中MDA含量，原因可能为菌株发挥抗氧化作用和MRS培养基中含有较
高的脂质过氧化物.
3.4 黏附性能
益生菌能通过与致病菌竞争黏附位点、营养物质和产生有机酸、细菌素等物质干扰致病菌在肠上皮细胞上的黏附，抑制肠道致病菌[27]，维持肠道菌群平衡[28].本试验中，嗜酸乳杆菌的黏附指数随着嗜酸乳杆菌浓度的增高而增加，当菌株浓度为109CFU/mL时，菌株黏附指数最高，为1 050 CFU/100 cell.这与白东宁等[29]研究结果一致，其研究表明随着嗜酸乳杆菌浓度的增高，菌株对山羊子宫内膜上皮细胞的黏附指数也随之升高，菌株浓度为109CFU/mL时，黏附指数最高.而王红艳等[30]研究嗜酸乳杆菌对生殖道上皮细胞的黏附特性时，结果显示，嗜酸乳杆菌浓度为2×107CFU/mL，培养12 h时，黏附指数最高，为1 042 CFU/100 cell，与本试验研究结果存在差异，原因可能为不同菌株之间的特性差异和试验细胞、培养时间等条件的不同，表明菌株在不同条件下的黏附指数存在差异.综上所述，该菌株对猪肠上皮细胞具有较好的黏附特性.
4 结论
本研究对自主分离选育的猪源嗜酸乳杆菌进行了生长曲线、产酸力、抑菌性、黏附性及抗氧化能力等规律研究，证明了该菌株具有良好的益生特性，在绿色饲料添加剂和健康养猪生产中具有良好的开发应用前景.
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