生物化学第11章柠檬酸循环

琥珀酰CoA合酶催化的反应涉及到CoA被磷酸基取代， 在该酶的活性部位形成琥珀酰基磷酸(succinyl phosphate)。然后，磷酸基转移到酶活性部位的His残基 上，形成磷酸组氨酸，并释放出琥珀酸；随后磷酸基被 转移到GDP上，生成GTP。
琥珀酰CoA合酶催化的反应
（六）
琥珀酸氧化形成延胡索酸
（四）
α-酮戊二酸氧化脱羧产生琥珀酰CoA
α-酮戊二酸在α-酮戊二酸脱氢酶复合物的催化 下，氧化脱羧，产生琥珀酰CoA，同时释放出CO2和NADH。 这里，释放出CO2同样来自原初的草酰乙酸部分而不是 来自乙酰CoA的乙酰基。 如果说，顺乌头酸酶对柠檬酸的两个相同的基团没 有选择性，α-酮戊二酸脱羧反应释放出CO2应有一半含 有放射性标记，但是，实际结果没有。这证实了顺乌头 酸酶具有选择性。
E1:丙酮酸脱氢酶 E2:二硫辛酸转乙酰基酶 E3:二氢硫辛酸转乙酰基酶
丙酮酸脱氢酶系 多酶体系，位于线粒体膜上。 E.coli的丙酮酸脱氢酶系 分子量：4.5×106，直径45nm，比核糖体稍大。 酶 丙酮酸脱氢酶（E1） 二氢硫辛酰转乙酰酶（E2） 二氢硫辛酰脱氢酶（E3） 辅酶 TPP 硫辛酸 FAD 亚基数 24 24 12
柠檬酸合酶反应的机制
（二）异柠檬酸的形成 柠檬酸在顺乌头酸酶(aconitase)的催化下，异 构化转变成异柠檬酸(isocitrate)。顺乌头酸(cisaconitate)是这一转变反应的中间物。该步反应是可 逆的，△Go'＝﹢6.3 kJ/mol，反应有利于柠檬酸。 因此，在平衡时，异柠檬酸大约只占10%。
第一节
丙 酮 酸 氧 化
在有氧的条件下，糖酵解产生的丙酮酸或乳酸氧化 产生的丙酮酸或者某些氨基酸分解产生的丙酮酸经特 殊的载体蛋白转运到线粒体内，首先经氧化脱羧反应 转变成乙酰CoA。
一
丙酮酸脱氢酶复合物
丙酮酸氧化脱羧形成乙酰CoA的反应是由丙酮酸脱 氢酶复合物催化的。这个酶复合物由丙酮酸脱氢酶(E1)、 二氢硫辛酰转乙酰基酶(E2) 和二氢硫辛酰脱氢酶(E3)三种 酶构成. 每一种酶在该复合物中均有多个拷贝。
柠檬酸(TCA)循环过程中关键的化合物是柠檬 酸，因为柠檬酸有三个羧基，所以又称三羧酸循 环 （tricarboxylic acid cycle，TCA）。
柠檬酸循环在细胞的线粒体中进行。柠檬酸 循环不仅是糖的有氧分解代谢途径，也是脂肪酸 和氨基酸的分解代谢途径，柠檬酸循环的中间物 还是许多物质生物合成的前体。
当柠檬酸与 顺乌头酸酶 的活性中心 结合时，酶 活性中心的 微环境能区 别在空间取 向上不同的 两个相同的 基团，使得 两个相同的 基团中只有 一个被酶作 用，而另一 个则不能被 酶催化。
（三） 异柠檬酸的氧化脱羧 异柠檬酸脱氢酶催化异柠檬酸氧化脱羧转变成α-酮戊 二酸。这是柠檬酸循环的第一步脱羧反应。在该反应中伴 随NAD＋还原产生NADH。注意，这里脱去的CO2来自原初的 草酰乙酸部分，而不是乙酰CoA的乙酰基部分。 在该酶的催化反应中，异柠檬酸的二级醇羟基氧化，转 变成草酰琥珀酸(oxalosuccinate)，接着β-位羧基发生 脱羧反应，生成α-酮戊二酸。Mn2＋在反应中起着使新形 成的羰基极化的作用。 这一反应的△Go'是-20.9 kJ/mol，能有效地推动顺乌头 酸酶催化异柠檬酸的生成反应。
这表明在糖的无氧分解产物中还蕴藏 着极为丰富的能量，乳酸分子中还含有葡萄 糖分子93%的可供利用的能量。 在有氧的条件下，最终被氧化成CO2和 H 2 O。 这样的代谢过程称为呼吸(respiration) 或细胞呼吸。 因为这一过程消耗氧，释放出CO2。
细胞呼吸可分为三个不同的阶段: 第一阶段是葡萄糖经糖酵解转变成丙 酮酸，丙酮酸再被氧化成乙酰CoA；对 于细胞呼吸的其他有机燃料分子脂肪 酸以及氨基酸，经相应的代谢途径亦 可转变成乙酰CoA。 第二阶段是指有机燃料分子氧化产生 的乙酰CoA进入一个称为柠檬酸循环的 代谢途径，被酶促转变成CO2，同时产 生还原性的电子载体NADH和FADH2。 第三阶段是指前两个阶段产生的还原 性的NADH和FADH2被氧化，重新形成氧 化型的辅酶。
此外，还需要辅酶A(CoA)、 NAD+ 、Mg2+作为辅因子，辅酶A 是重要的酰基载体。
E1使丙酮酸 脱羧生成羟 乙酰－TPP
E2 从TPP上接受含负 碳离子的羟乙酸交给 CoA生成乙酰CoA E3辅基FAD从二 氢硫辛酸上接 受氢，然后转 交给NAD+,生成 NADH
第二节
ห้องสมุดไป่ตู้
柠 檬 酸 循 环
1516柠檬酸三羧酸三羧酸循环概貌循环概貌由丙酮酸形成的乙酰coa或者是其它代谢途径如脂肪酸或氨基酸的分解代谢途径产生的乙酰coa可以通过柠檬酸循环氧化柠檬酸循环涉柠檬酸循环的反应过程一柠檬酸的生成柠檬酸合酶citratesynthase催化乙酰coa与草酰乙酸的缩合生成柠檬酸
第 十 一 章 柠 檬 酸 循 环
柠檬酸(三羧酸) 循环概貌
由丙酮酸形成 的乙酰CoA或者 是其它代谢途 径（如脂肪酸 或氨基酸的分 解代谢途径） 产生的乙酰CoA 可以通过柠檬 酸循环氧化， 柠檬酸循环涉 及八步酶促反 应。
二、
柠檬酸循环的反应过程
（一）柠檬酸的生成 柠檬酸合酶(citrate synthase)催化乙酰CoA与草酰乙酸 的缩合，生成柠檬酸. 这是柠檬酸循环的起始反应。同位素标记 实验表明，乙酰基上的甲基碳与草酰乙酸的羰基碳结合。柠檬酸合 酶催化的反应遵循有序顺序反应机制。由于乙酰CoA是一种高能化 合物，当硫酯键被水解时，可释放出大量的能量(△Go’= - 32.5 kJ/mol)，因而在细胞内能推动反应向柠檬酸生成的方向进行。柠 檬酸合酶催化的反应是不可逆的，受到多种效应物的调节。
（五）
琥珀酰CoA氧化转变成为琥珀酸
琥珀酰CoA合成酶(succinyl-CoA synthetase)催 化琥珀酰CoA裂解产生琥珀酸，并伴随高能磷酸化合物 (GTP或ATP)的生成。该反应的△Go'约为–2.1 kJ/mol。 这是柠檬酸循环中唯一直接产生高能磷酸化合物的反 应，是底物水平磷酸化的又一个例子。由于其逆反应 能形成硫酯键，因此，该酶亦称之为琥珀酸硫激酶 (succinate thiokinase)。
α-酮戊二酸脱氢酶复合物催化的反应在化学上与丙 酮酸脱氢酶复合物相似。这个酶复合物也是由三种 酶组成： α-酮戊二酸脱氢酶(E1)、 二氢硫辛酰转琥珀酰基酶(E2) 二氢硫辛酰脱氢酶(E3)。 E1和E2作用的底物不同， 这里E3与丙酮酸脱氢酶复合物的E3相同。
α-酮戊二酸脱氢酶复合物催化的是一个高度放 能的反应(△Go'＝-33 kJ/mol)，反应产生的琥 珀酰CoA象乙酰CoA一样，含有一个高能硫酯键。
在哺乳动物体内，该反应通常合成的是GTP； 植物和细菌的琥珀酰CoA合成酶则通常合成ATP。 哺乳动物体产生的GTP在核苷二磷酸激酶 (nucleoside diphosphate kinase)催化下，可以 将它末端的磷酸基转移到ADP上，生成ATP： GTP ＋ ADP ←→ GDP ＋ ATP
在无氧的条件下，葡萄糖经糖酵解反应获取能量，产 生的丙酮酸被还原为乳酸(或酒精)： C6H12O6 →→→ 2 H3C-CHOH-COO－ + 2H＋ △Go'＝ -196 kJ/mol 但是，在有氧的条件下，葡萄糖则完全氧化成CO2和 H2O，并产生细胞活性所需的大量的能量： C6H12O6 + 6O2 → 6CO2 + 6H2O △Go'＝ -2867 kJ/mol
（七）
延胡索酸的水合反应
延胡索酸在延胡索酸酶(fumarase)催化下，双键水合 生成L-苹果酸(L-malate) 。 所以延胡索酸酶也叫做延胡索 酸水合酶(fumarate hydratase)。水合反应很可能先形成负 碳离子的转换态形式。转换态形成中，首先受到OH－阴离子的 攻击，形成负碳离子，接着发生质子(H＋)化反应。 该反应△Go'＝- 3.4 kJ/mol。
草酰琥珀酸是异柠檬酸脱氢酶催化反应的中间物，它 只是瞬间存在。但是酶活性部位的残基(Tyr160和Lys230) 如发生突变，则使该酶的活性降低(即产生动力学“瓶 颈”)，造成反应中间物的积累而证实它的存在。 在哺乳动物组织中也存在依赖于NADP＋的异柠檬酸脱 氢酶。
异柠檬酸脱氢酶的反应机制。
Mn2+使草酰琥珀酸中间物上的羰基极化
延胡索酸酶具有很高的立体专一性。它只作 用于延胡索酸，从双键的相反方向加OH－和H＋， 生成L-苹果酸，或者催化其逆反应，L-苹果酸脱 水变成延胡索酸。该酶不能催化顺丁烯二酸加水 变成苹果酸，也不能催化D-苹果酸的脱水反应。
延胡羧酸水和 反应的过程
（八）
草酰乙酸的生成
苹果酸氧化转变成草酰乙酸是柠檬酸循环的最后一步 反应。催化这一反应的酶是L-苹果酸脱氢酶(L-malate dehydrogenase))。该反应△Go‘＝ + 29.7 kJ/mol，在热力 学上不利于草酰乙酸的生成，而有利于逆向反应。 因此，草酰乙酸在细胞内的浓度是很低的。但是，在 细胞内，不利于草酰乙酸生成的反应可以被柠檬酸循环的第 一步反应(由柠檬酸合酶催化)所推动，向有利于草酰乙酸生 成的方向进行。因为柠檬酸合酶催化乙酰CoA与草酰乙酸的 缩合反应是高能放能的(△Go'＝ -31.5 kJ/mol) 。
琥珀酸氧化转变成延胡索酸是在琥珀酸脱氢酶 (succinate dehydrogenase)催化下进行的。FAD作为该酶 的辅基，共价结合在酶的一个His残基上，在酶促反应中 接受底物氧化脱下的电子和氢。这一反应的自由能变化接 近﹣6 kJ/mol。 琥珀酸脱氢酶是柠檬酸循环中唯一的线粒体内膜结合 蛋白，也是琥珀酸-CoQ氧化还原酶的一部分。琥珀酸的氧 化涉及从它中间两个碳原子的相反两侧各除去一个H原子。 这一涉及烷氧化成烯的反应，没有足够的能量使NAD＋还原， 但却能使FAD还原为FADH2。与此相反，醇、或酮的氧化反 应，可以产生足够的能量推动NAD＋的还原。
琥珀酸脱氢酶是一种由分子量为70kD和27kD两个 亚基构成的二聚体蛋白。FAD共价地结合到大亚基上。 琥珀酸脱氢酶也含有铁-硫簇。该酶催化的反应具有立 体专一性，它只能催化琥珀酸从相反位置脱氢转变成 延胡索酸(反丁烯二酸)或其逆反应，但不能催化琥珀 酸从同一侧脱氢产生顺丁烯二酸或其逆反应。
由于琥珀酸脱氢酶没有区分琥珀酸相同两端的能力，如 果用于柠檬酸合成的乙酰基的羰基碳事先用14C标记，那么经 上述6步反应生成的琥珀酸的羧基碳均应含有放射性标记，只 不过每个羧基碳的放射性强度只保有原初标记的50%，其后每 种化合物的羧基碳原子均同样如此。
大肠杆菌丙酮酸脱氢酶复合物分子量约4600kD, 外形 呈球形，其直径约为30nm。该复合物的核心由24个E2构成， 24个E1和12个E3环绕E2排列。真核生物丙酮酸脱氢酶复合 物比大肠杆菌的酶更为复杂。
二
丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应
丙酮酸脱氢酶复合物催化五步顺序反应，其总反应是： CH3-CO-COO－ ＋ CoA-SH ＋ NAD＋ → CH3-CO～CoA ＋ CO2 ＋ NADH 在丙酮酸脱氢酶复合物催化的反应中涉及五种不同 的辅酶，它们分别是焦磷酸硫胺素(TPP)、硫辛酸 (lipoic acid)、辅酶A(CoA)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NAD＋)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)。
]顺乌头酸酶
顺乌头酸酶
柠檬酸是一种前手性分子，然而顺乌头酸酶却能对 柠檬酸两端的两个相同的基团(-CH2-COO－ )具有选择性。 如反应式所指出的，脱水和加水反应只涉及到柠檬酸的下半部分 (即来自草酰乙酸碳原子上的基团)。对这种选择的解释是：根据 酶作用的立体专一性，酶分子活性中心是不对称的，有三个不同 的结合位，这三个不同的结合位只有在与底物分子的三个不同的 取代基互补配对时，该酶才能进行催化。 柠檬酸的中心碳连接有四个取代基，其中两个是相同的 (-CH2-COO－)。但是这两个相同的基团在空间取向上是不同的， 也就是说在空间上是可以区别的。顺乌头酸酶的这种作用特性就 解释了为什么后续的脱羧反应只发生在与乙酰基参入部位相对的 碳位上，而不发生在乙酰基参入部位这一端。
柠檬酸循环(citric acid cycle)是乙酰基二碳单位进 一步氧化降解产生CO2和还原型辅酶的代谢途径。由于该反应顺 序是乙酰CoA与草酰乙酸缩合成柠檬酸开始的，且草酰乙酸经多 步反应之后重新生成，构成了一个循环反应途径，因此，该循环 反应称为柠檬酸循环。
一.柠檬酸循环的研究历史
柠檬酸循环处在物质代谢的中心位置，该途径的发现在 生物化学发展史上占据着重要的位置。 德国科学家Hans Krebs 在阐明柠檬酸循环中作出特殊贡献， 1953年获得诺贝尔医学奖，柠檬酸循环又称Krebs循环。