类风关巴布剂穴位贴敷对胶原诱导关节炎大鼠滑膜细胞核转录因子κβ表达的阻碍

类风关巴布剂穴位贴敷对胶原诱导关节炎大鼠滑膜细胞核转录因子-κβ表达的阻碍
叶天申,邹贤斐,金可可,朱小春,林向阳,陈勇
【摘要】目的比较不同组合穴位贴敷类风关巴布剂对牛Ⅱ型胶原诱导关节炎(CIA)大鼠滑膜细胞核转录因子-κβ(NF-κβ)表达的阻碍。

方式大鼠背部5处皮内注射牛Ⅱ型胶原诱导大鼠关节炎,观看以雷公藤为主的中药类风关巴布剂不同组合穴位贴敷对模型大鼠免疫组化指标NF-κβ计分,和滑膜细胞上清液的白细胞介素-1β(IL-1β)与肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的阻碍。

结果类风关巴布剂医治后,各穴位贴敷组大鼠的NF-κβ计分较模型组降低, 其中系统组(远近配穴)最接近正常组；各组滑膜浸液中IL-1β、TNF-α浓度降低。

结论类风关巴布剂穴位贴敷能够降低CIA大鼠滑膜细胞的NF-κβ的蛋白表达,并降低相关细胞因子的浓度,抑制正反馈效应；远近配穴可能通过标本兼治,多靶点起效,使其整体疗效优于单纯远道取穴或局部取穴。

【关键词】关节炎,类风关巴布剂；大鼠；核转录因子-κβ；肿瘤坏死因子-α；白细胞介素-1β
类风湿关节炎(RA)是慢性全身性自身免疫性疾病，其病理基础为关节滑膜的过度增生,诱导异样增生的滑膜组织发生凋亡可能成为医治RA的有效途径。

滑膜的增生与凋亡之间的平稳受多种因素的制约,
细胞因子是其因素之一。

在众多细胞因子中,肿瘤坏死因子(TNF)-α和白细胞介素(IL)-1β扮演着重要的角色。

研究说明,TNF-α抑制细胞发生凋亡的机制受核转录因子-κβ(Nuclear factor-κβ,NF-κβ)的调控[1], Yamasaki等[2]研究以为NF-κβ可能是医治RA的目标分子。

本实验通过对牛Ⅱ型胶原(BcⅡ)诱导关节炎(CIA)大鼠不同组合穴位贴敷类风关巴布剂,观看其对大鼠滑膜细胞NF-κβ表达的阻碍,并初步探讨经络腧穴在其中的作用。

1 实验材料
动物
Wistar大鼠,清洁级健康雄性,80只,体重(120±15)g,购
于上海斯莱克实验动物有限责任公司,正常饲养。

药物与试剂
雷公藤、白花蛇舌草、乳香、没药；BcⅡ,Chondrex公司(美国)；完全弗氏佐剂,Sigma公司(美国)；IL-1βELISA kit购于Biosource公司(美国)；TNF-α ELISA kit购于Biosource公司(美国)；NF-κβ购于santa cruz Biotechnology,inc(美国)；多聚赖氨酸玻片100张,EiVision＋PolymerHRP(Ms/Rb) IHC Kit 6 mL。

仪器
显微镜OLYMPUS(日本),低温高速离心机BECKMEN(美国),酶标仪Bio-rad680(美国)。

2 实验方式
类风关巴布剂的组成及制作方式
雷公藤、白花蛇舌草、乳香、没药等,共12味,按固定剂量配伍(其中雷公藤占总药量的28%),晒干,研粉,过20目筛,用80%乙醇渗漉提取,然后过滤取液,经低温低压(50 ℃,个大气压)蒸馏去乙醇后得浸膏。

将浸膏按必然比例加入事前配制的巴布剂基质(要紧成份明胶、甘油、聚丙烯酸钠等)中,并加入%的促渗剂(氮酮)、必然比例的乳化剂及防腐剂等,充分溶合,均匀涂布于无纺布上,覆盖聚乙烯薄膜,切成3 cm×3 cm的方块(重量１ g),密封包装,阴凉处贮存备用。

造模和分组
随机从100只大鼠当选出10只为正常对照,其余90只用于造模,参照文献[3]方式配制成Ⅱ型胶原乳剂。

具体方式为：在无菌条件
下,用 mol/L冰醋酸充分溶解BcⅡ,浓度为4 mg/mL,置4 ℃冰箱留宿后,与弗氏完全佐剂等体积混合、振荡乳化,制成BcⅡ乳剂(即每 mL 含1 mg BcⅡ)。

置4 ℃冰箱保留备用。

注射方式：于大鼠背部及尾根分5点行皮内注射,每点 mL,总量 mL(含1 mg BcⅡ型胶原)。

15 d后同法分2点皮内激发注射。

正常对照组予以生理盐水同法注射。

第一次免疫25 d后参照关节炎指数评分标准[1]对造模成效进行评估,评分达6分以上的大鼠被用于继续实验。

将造模成功的大鼠随机分为4组,即类风关巴布剂局部穴位贴敷组(局部组)、类风关巴布剂远道穴位贴敷组(远道组)、类风关巴布剂系统穴位贴敷组(系统组)和模型对照组(模型组)各10只。

给药
依照临床及有关动物实验的取穴方案[4]取穴。

系统组：大椎、双侧肾俞、双侧太溪,共5个穴点；远道组：大椎、双侧肾俞,共3个穴点；局部组：双侧太溪,共2个穴点。

依照贴敷总面积相同(剂量相等)的原那么,系统组每穴贴敷面积为 cm2的圆形巴布剂(半径 cm)；远道组每穴贴敷面积为 cm2(半径 cm)；局部组每穴贴敷面积为 cm2 (半径 cm)。

在穴位处脱毛后贴敷,每3 d贴敷1次,共5次,每次雷公藤甲素剂量约为μg[5]。

正常组和模型组仿照局部组贴敷不含药物的巴布剂基质。

15 d后各组同时处死取标本。

取材
大鼠称重,用2%戊巴比妥纳腹腔麻醉,仰位固定,沿着左侧后腿膝关节正中纵行切开皮肤直至暴露出膝关节位中心约 3 cm×3 cm 的区域。

沿髌骨上缘约～ cm处向下切割至股骨,再别离沿髌骨双侧向下分离至胫骨,现在即打开了膝关节腔,可见由髌骨下极向下延续有一层滑腻光亮呈浅淡黄色的滑膜组织。

用眼科直镊轻轻夹住其中央,用眼科剪完整剪下,置10%的中性甲醛中固定,用于检测NF-κβ的免疫组织化学染色。

同法取右边滑膜,滑膜掏出以后,用生理盐水1 mL冲洗关节腔,搜集关节腔液和关节滑膜组织,用于IL-1β、TNF-α的检测。

检测指标
细胞因子的检测
IL-1β、TNF-α活性测定采纳ELISA法,依照所附说明书测定关节滑膜组织溶浆的活性。

先加入标准品和待测样品,设置阴性对照,加入生物素结合的一抗(IL-1β、TNF-α),37 ℃温箱孵育2 h,然后用洗涤液充分洗涤4次,向滤纸印干。

加入辣根过氧化物酶标记的二抗工作液25 ℃孵育1 h,再用洗涤液充分洗涤4次,向滤纸印干。

加入显色液25 ℃孵育30 min后加入终止液。

上机检测吸光度值。

滑膜组织核转录因子-κβ的免疫组化ABC染色
预备组织切片(石蜡切片脱蜡至水,冰冻切片和细胞培育片用适当方式固定)；抗原修复(微波加热法,适用石蜡切片),将切片置于耐高温容器中,注入抗原修复液,使切片位于液面以下。

置微波炉内加热使容器内液体温度维持在92～98 ℃之间并持续5 min,掏出容器,室温冷却,30～50 min后降至室温。

用TBS 冲洗切片4～5次,甩干,擦净,加20 μL 3% H2O2-甲醇溶液(Reagent F),于室温湿盒中封锁30 min。

掏出切片,用TBS冲洗4～5次,甩干,擦净。

用封锁液(Reagent B)20 μL覆盖,室温湿盒孵育30 min。

用吸水纸将封锁液吸去,勿洗,滴加适当比例稀释的一抗。

37 ℃孵育1～2 h或4 ℃留宿。

TBS冲洗4～5次,甩干,擦净。

滴加生物素标记二抗(Reagent C)20 μL,室温湿盒孵育1～2 h。

TBS冲洗4～5次,甩干,擦净。

滴加酶标亲和素(Reagent D)20 μL,室温湿盒孵育30 min。

TBS冲洗4～5次,滴加DAB工作液(Reagent E)约30 μL/片,着色后迅速(约1 min内)冲洗干净。

20 μL苏木精(Reagent G)复染。

冲洗干净脱水封片,镜检。

核转录因子-κβ积分[6]
在滑膜组织中NF-κβ表达阳性的滑膜组织细胞核呈橘黄色或棕黄色,每张切片沿滑膜组织带计算400倍视野中阳性细胞的占有率,计数3个视野,标出每一个视野平均阳性细胞占有率,并按阳性细
胞占有率分为5级：“0”为无阳性细胞,“+”为阳性细胞0～25%,“++”为阳性细胞25%～50%,“+++”为阳性细胞50%～75%,“++++”为阳性细胞75%～100%。

0级积分为0,“+”积分为1,以此类推。

统计学方式
用统计软件,假设数据为正态散布整体比较采纳多组单因素方差分析,组间比较用q查验(Newman- Keuls法),不然用秩和查验的Kruskal-Wallis法和Nemenyi法,P<以为有统计学意义。

3 结果
(见表一、表2)表1 各组大鼠滑膜细胞NF-κβ的表达(略)注：与模型组比较,▲P<,▲▲P<(下同)表2 各组大鼠滑膜浸液的TNF-α、IL-1β水平比较(x±s,ng/mL) 4 讨论
NF-κβ是1986年由Sen和Baltimore第一报导[7],并发觉B细胞核提取物中有一种核蛋白能与免疫球蛋白K轻链基因增强子κβ序列特异结合,增进了K轻链的表达,被称为NF-κβ。

愈来愈多的证听说明,在RA发病的进程中,NF-κβ做为转录因子家族成员参与了滑膜组织的过度增生和炎症进程[8]。

NF-κβ在胞浆中与其抑制亚单位Ⅰ-κβ结合而处于未活化状态,并可被TNF-α、IL-１β等不同的
信号所激活,其活化那么有赖于胞浆中Ⅰ-κβ的降解。

在正常滑膜,NF-κβ的表达量很低[9]。

在RA的滑膜中,免疫活性NF-κβ蛋白p50和p65大量表达于衬里层细胞和血管内皮细胞中[10]。

NF-κβ的活化在RA初期滑膜炎症和增生的进程中起中心罪犯作用[11]。

在正常细胞组成性表达活化的NF-κβ仅见于成熟B细胞、浆细胞和某些神经元中,而其他大多数细胞的NF-κβ需在外界的刺激诱导下发生激活。

许多细胞外因素可诱导NF-κβ的活化,如炎性细胞因子TNF-α、IL-1β等,但最终都通过IKK使Ⅰ-κβ降解而与NF-κβ解离,暴露NF-κβ的NLS,使NF-κβ经核孔进入核内,与DNA靶序列结合,发挥转录调控效应；而NF-κβ的活化致使了许多基因的表达,以直接或间接的方式调剂机体的生理和病理反映。

在此进程中,TNF-α、IL-1β等前炎细胞因子在NF-κβ作用下生成增加,它们作为外界刺激因子进一步活化NF-κβ信号通路,产生正反馈放大作用,这是NF-κβ迅速动员、反映灵敏的重要条件。

但是,由于NF-κβ活化致使大量细胞因子、酶等生物活性物质的产生,它的过度活化必然致使机体的病理反映和损伤,正常细胞内NF-κβ的活化是在细胞内外通路的正、负反馈的精细调剂下,使NF-κβ的活化维持在适当的水平。

正、负两种反馈调剂往往同时进行,NF-κβ是不是处于活化状态那么取决于何种调剂占优势。

CIA的产生和进展与RA有着很多的相似性,二者都依托于自
身反映性T细胞和B细胞的激活,并能产生类似类风湿因子的抗体。

Seetharaman等[12]在CIA大鼠的研究说明,关于Ⅰ型和Ⅱ型T细胞依托的免疫应答而言,抗体诱导NF-κβ的活化要紧致使T细胞依托的免疫应答,抑制NF-κβ信号通路,使血清TNF-γ、IgG2a抗Ⅱ型胶原(C Ⅱ)抗体水平明显下降而IgG1水平不变,CD8+T细胞减少,CIA发病率及严峻性明显减少和减轻。

因此,本实验选用CIA大鼠为模型。

RA属于中医学“痹证”范围,最近几年来,大量研究以为雷公藤对CIA大鼠有效,并有采纳含雷公藤的复方中药穴位贴敷医治CIA 大鼠的研究[13]。

咱们将以雷公藤为主药的复方中药制剂与针灸穴位有机结合,研制类风关巴布剂,并进行了毒理、制剂学及临床的研究,在大鼠佐剂性关节炎穴位贴敷研究中,证明相同的给药剂量(贴敷面积)不同的穴位组合作用有不同,以系统组(远近配穴)最正确[14]。

另据研究,雷公藤甲素能够下调CIA大鼠滑膜细胞TNF-α的表达,同时还能够有效抑制NF-κβ的表达与活性[15]。

本实验中,造模后NF-κβ积分水平明显升高,医治后各组都有所下降,以系统组最接近正常,同时医治后各组滑膜浸液的TNF-α、IL-1β水平也有明显下降。

因此,类风关巴布剂穴位贴敷能够有效打破NF-κβ与TNF-α、IL-1β之间的正反馈调剂的恶性循环。

在本次实验中,除药物的疗效外,合理用穴也是关键要素,一方面,通过经络腧穴给药对药效的放大作用来提高疗效,另外,远近配
穴可能通过标本兼治,多靶点起效,使其整体疗效优于单纯远道取穴或局部取穴。

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