抗流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定ppt课件

2B7
1C11
4G7
supernatant 320
80
80
ELISA
Ascite fluids
211×100 28×100 27×100
supernatant 24
21
21
HI
Ascite fluids
212
28
27
2.3.6 单抗特异性鉴定
将抗NP单抗1D10、1G11分别用鸡新城疫病 毒、传染性支气管炎病毒、产蛋下降综合征病毒、 传染性喉气管炎病毒包被的酶标板作间接ELISA 检测，检测结果全部为阴性，阐明所制备的单抗 与这些病毒均无交叉反响。
抗NP单抗与 H1N1亚型感染MDCK的 IFA检测
A 1G11
B 1D10
F Positive control G SP2/0 H MDCK cells control
抗H3HA单抗与H1N1亚型感染MDCK的 IFA检测
C 2B7
D 1C11
E 4G7
F Positive control G SP2/0 H MDCK cells control
2.2 资料方法 2.2.1 细胞、病毒与动物
SP2/0骨髓瘤细胞系由本实验室保管。 流感病毒H9N2、H1N1由本实验室分别 鉴定，保管。H3N8由哈尔滨 兽医研讨所提 供。新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病 毒(IBV)、传染性喉气管炎病毒(ILTV)、传染 性法氏囊病毒(IBDV)、产蛋下降综合征病毒 〔EDS-76〕、禽腺病毒1型〔APMV-1〕购 自北京梅里亚维通公司。 SPF鸡胚购自北京梅里亚维通公司。 BALB/C小鼠购自湖北省疾病控制中心 实验动物中心。
抗流感病毒单克隆抗体的制备与鉴定
1.文献综述 2.单抗的制备与鉴定
目的意义 资料方法 结果与分析 3.讨论
1.文献综述
1.1 流感的病原学 流感病毒在病毒分类学上属正粘病毒科 －A型、B型流感病毒属和C型流感病毒属 A型流感病毒亚型 －HA: 16 －NA: 10 高致病性禽流感 (HPAI) --H5 and H7
1D10
1G11
supernatant Ascite fluids supernatant Ascite fluids
200
213×100
200
212×100
400
212×100
400
211×100
400
214×100
400
213×100
NP
200
212×100
200
210×100
表2－4 抗H3 HA蛋白杂交瘤上清和腹 水的效价测定结果
3.3 关于抗H3N8 HA蛋白单抗
本研讨所制备的3株高效价的抗HA蛋白的 单抗用H1、H3、H5、H9亚型禽流感病毒及鸡 新城疫病毒作血凝抑制实验，检测结果三种单 抗只对H3亚型禽流感病毒有血凝抑制效价
阐明所制备的单抗与这些病毒均无交叉反 响，具有很好的特异性。
3.3 关于抗H3N8 HA蛋白单抗
抗H3 HA单抗2B7、1C11、4G7分别用H1、 H3、H5、H9亚型禽流感病毒及鸡新城疫病毒作 血凝抑制实验，检测结果三种单抗只对H3亚型流 感病毒有血凝抑制效价，阐明阐明所制备的单抗 与这些病毒均无交叉反响。
2.3.7 间接免疫荧光
分别以一定浓度H1、H3、H9亚型流 感病毒感染MDCK细胞，固定细胞后进展荧 光染色检测腹水。
2.2.2 培育基及主要试剂
RPMI-1640、HAT、HT、弗氏完全与不完全佐剂： GIBCOL公司。
新生小牛血清〔超级〕：四季青生物工程公司。 精制小牛血清：Hyclone公司。 交融剂50％PEG〔P7181〕、羊抗鼠IgG-HRP、 8－氮鸟嘌呤：SIGMA公司。 羊抗鼠IgG1、G2a－HRP ：SBA公司。 青、链霉素：华北制药厂。
2.1 研讨目的与意义
流感的监控任务是预防与控制该病的一个重 要环节。国内对流感病毒的临床诊断主要是对抗 体的检测。
病毒抗原检测方面，虽然病毒的分别鉴定是 诊断禽流感的一种可靠方法，但病毒的分别鉴定、 动物接种实验操作复杂，周期长，难以满足对高 致病性禽流感快速诊断的需求。聚合酶链式反响 〔PCR〕、核酸探针等方法那么需求较好的实验 条件和较高的人员素质，目前还难以广泛推行 。
赞赏我的教师、亲人和朋友，赞赏一 切给我协助和支持的人。
3 讨论
3.1 单抗制备中需留意的问题 动物的免疫 细胞交融 杂交瘤细胞的挑选 杂交瘤细胞的克隆 杂交瘤细胞的冻存和复苏 污染的预防和排除
3.2 关于抗NP蛋白单抗
由于禽流感病毒NP蛋白相对保守， 因此可以运用抗NP蛋白的抗体来检测 一切亚型的禽流感病毒。
NP蛋白并非完全保守，因此要保 证所制备的单抗是针对其保守性抗原 位点的。
2 单抗的制备与鉴定 2.1 研讨目的与意义
流感是第一个实行全球监控的传染性疾病。对 人及禽、畜的危害非常宏大。除禽流感外，常见的 还有人流感、马流感和猪流感等。
动物流感尤其是禽流感与人类流感和人类安康 非常亲密，禽流感被以为是人流感病毒的保管和发 生变异的新基因的来源，这种联络是经过中间宿主 来实现的。猪是人源、禽源和猪源流感病毒的独一 共同易感宿主，它能将流感病毒传播给人。
HA是流感病毒的主要外表抗原，普通情 况下，新分别的毒株鉴定，普通要做HA的亚 型鉴定，故研讨针对HA的Mabs，并以其建立 快速的检测方法，具有非常重要的意义。
本研讨中制备的3株抗H3亚型的Mabs， 为抗原分型、血清学诊断、疫苗质量监控及流 行病学调查奠定了根底。
致谢
赞赏导师金梅林教授的指点和教导以 及三年来的关怀、支持和鼓励。
为二抗用间接ELISA 鉴定了单克隆抗体
的亚类。
结果见表2－2。
表2－2 单克隆抗体亚型及相应杂交瘤细胞 染色体计数
Antigen Cells
Splenocyte SP2/0
Hybridoma
1D10
NP
1G11
2B7
HA
1C11
4G7
Antibody isotypes
G2a G1 G2a G1 G2a
3.2 关于抗NP蛋白单抗
为了证明所产生的单克隆抗体确实 是针对病毒NP蛋白保守性位点的，采 用了多株禽流感病毒和表达的NP蛋白 正挑选、阴性尿囊液及破碎的菌体负 挑选的方法，挑选到了6株针对禽流感 病毒NP蛋白保守性位点的单抗，其中 2株是高效价的单抗。
3.2 关于抗NP蛋白单抗
本实验所制备的2株高效价的抗NP蛋白 的单抗用鸡新城疫病毒、传染性支气管炎 病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性喉气 管炎病毒检测，均无交叉反响，具有很好 的特异性。
2.1 研讨目的与意义
流感病毒的HA蛋白具有亚型特异性，但NP蛋白却相 对保守。
利用NP蛋白和HA蛋白分别有望建立一种一切亚型禽流 感病毒的检测方法和诊断流感病毒亚型的方法。而单克隆 抗体由于由于特异性以及高度亲和力，用于病毒学诊断时 相较于多抗有许多优点。
本研讨利用杂交瘤技术获得了抗禽流感病毒NP蛋白和 H3亚型禽流感病毒HA蛋白的单抗，为对禽流感病毒的进一 步研讨和建立针对一切亚型禽流感病毒和H3亚型的检测方 法奠定根底。
经2 次检测、3 次克隆后获得3株稳定分 泌抗HA蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，延 续培育数月，细胞生长良好，反复冻存复苏 后，仍坚持稳定的抗体分泌才干，分别命名 为2B7、1C11、4G7。
2.3.3 杂交瘤细胞染色体数的检测
杂交瘤细胞染色体计数结果见表
2－2。
2.3.4 单克隆抗体亚类鉴定
以羊抗鼠IgG、G1、G2a-HRP
抗NP杂交瘤细胞上清ELISA检测结果 (OD630)
Antigens 1D10 4F4 1C3 1G11 1C2 2E7
H1N1 H3N8 H9N2 阴性尿 囊液
NP BL21
0.831 1.086 0.975
0.132
1.182 N
0.408 0.567 0.419
0.040
1.037 N
0.276 0.401 0.362
抗NP单抗与H3N8感染MDCK的IFA检测
A 1G11
B 1D10
F Positive control G SP2/0 H MDCK cells control
抗H3 HA单抗与H3N8感染MDCK的IFA 检测
C 2B7
D 1C11
E 4G7
F Positive control G SP2/0 H MDCK cells control
0.052
0.464 N
0.598 1.159 0.687
0.053
1.011 N
0.198 0.513 0.367
0.095
0.521 N
0.211 0.456 0.386
N
0.811 0.057
注：N表示没有检测； 所建立的ELISA临界值均为0.2。
2.3.2 抗HA 蛋白杂交瘤细胞的挑选
经过血凝抑制实验进展挑选。
抗NP单抗与AIV H9亚型感染MDCK的 IFA检测
A 1G11
B 1D10
F Positive control G SP2/0 H MDCK cells control
抗H3 HA单抗与AIV H9亚型感染MDCK的 IFA检测
C 2B7Βιβλιοθήκη D 1C11E 4G7
F Positive control G SP2/0 H MDCK cells control
3.2 关于抗NP蛋白单抗
本研讨所获得的针对禽流感病毒NP蛋白的单 克隆抗体为禽流感的诊断，甚至是A型流感病毒 的诊断提供了高质量的试剂。
本实验室已在此根底上进展了双夹心ELISA 方法检测不同亚型的禽流感病毒的研讨，并曾经 研制出了相关试剂盒运用于临床检测，为实现实 验室诊断的规范化、开展流行病学调查研讨奠定 了很好的根底 。
1.2 流感病毒检测技术 1.2.1 病毒的分别鉴定 1.2.2 血清学诊断技术
血凝〔HA〕和血凝抑制〔HI〕实验 琼脂凝胶分散实验〔AGID〕 神经氨酸酶抑制实验〔NIT〕 病毒中和实验〔NT〕 免疫荧光技术〔IFT〕 酶联免疫吸附实验 〔ELISA〕
1.2.3 分子生物学诊断技术
PCR 诊断技术 实时荧光定量PCR NASBA法 核酸探针技术 M 检测法 基因芯片技术
2.3 结果与分析
2.3.1 抗NP蛋白杂交瘤细胞的挑选 用间接ELISA方法进展挑选。运用A法免
疫制备了1株抗NP蛋白的单抗1D10，运用B法 获得了4株单抗〔4F4、1C3、1G11、1C2〕， 运用C法获得了1株单抗(2E7)。
各株单抗用间接ELISA方法的检测结果如 表2－1所示，其中1D10和1G11效价最高，用 于以下的实验。
2.3.3 方法
病毒粒子的大量制备与纯化 免疫原的制备 动物免疫 SP2/0骨髓瘤细胞的活化与制备 免疫脾细胞的制备 细胞交融
2.3.3 方法
杂交瘤细胞上清检测 杂交瘤细胞的克隆化〔有限稀释法〕 杂交瘤细胞染色体数的检测 单克隆抗体的消费、纯化和效价测定 单克隆抗体亚类鉴定 单抗特异性鉴定 间接免疫荧光法检测单克隆抗体
The number of chromosomes
40 70
94(89~97) 83(81~86) 90(82~94) 98(92~103) 87(79~87)
2.3.5 单克隆抗体的消费和效价测定
表2－3 抗NP蛋白杂交瘤上清和腹水的 ELISA效价测定结果(OD630)
H1N1 H3N8 H9N2