甲醇 -氯化钙络合物提取两性霉素 B

甲醇 -氯化钙络合物提取两性霉素 B
发表时间：2015-07-15T15:46:51.717Z 来源：《科学教育前沿》2015年4期作者：张伟亮何蓓蓓崔凯新
[导读] 两性霉素 B 最早为美国的 E R Squibb（施贵宝公司）开发并生产，国内是由当时的华北制药厂于七十年代从庐山土壤中分离的菌株而开发的（亦称为庐山霉素）。

张伟亮何蓓蓓崔凯新（华北制药华胜有限公司河北石家庄 052160）
中图分类号：G71 文献标识码：A 文章编号：ISSN1004-1621（2015）04-010-02
两性霉素 B 最早为美国的 E R Squibb（施贵宝公司）开发并生产，国内是由当时的华北制药厂于七十年代从庐山土壤中分离的菌株而开发的（亦称为庐山霉素）。

近几年来，两性霉素 B 的全球需求量急剧增多，尤其是两性霉素 B 脂质体的开发和使用，使两性霉素 B 原料药的市场潜力猛增。

两性霉素 B 原料药多采用甲醇或乙醇水溶液在碱性条件下浸提，中性结晶的工艺，生产中用到了酸、碱以及剧烈的温度变化，提炼过程中两性霉素 B 的降解较多，容易导致最大单个杂质偏大、总含量降低。

甲醇 - 氯化钙体系为一反应机理复杂的络合物质，文献中对甲醇 - 氯化钙体系的介绍多为化学热泵，研究较早也较为系统[1]。

氯化钙溶解于甲醇后，由于氯化钙引起的溶液性质的变化，改变了甲醇对一类物质的溶解性，本文将该性质应用于两性霉素 B 的提炼，研究了其配制比例、使用方法，并对后续的分离、干燥工艺做了研究。

1.1 材料
1.1.1 试剂
甲醇，分析纯，北京庆盛达化工；氯化钙，天津鼎盛鑫化工；丙酮，分析纯，青岛世纪星公司；菌丝，本厂发酵。

1.1.2 仪器
紫外可见分光光度计，上海精科 752N；高效液相色谱Waters2695；离心机，深圳瑞鑫达 HDL-4。

1.2 方法
1.2.1 菌丝制备及其中两性霉素 B 浓度的测定发酵液过滤、洗涤、抽干得到滤饼。

取滤饼 0.1g，加10mlDMSO 搅拌 5 分钟，过滤，滤液稀释 30 倍，制得菌丝稀释液；取两性霉素 B 标准品 0.1g，加 100mlDMSO，至溶解，取1ml，用甲醇稀释至 50ml，制得标准对照稀释液。

用紫外可见分光光度计检测[2]两溶液 400~410nm 处最大吸光值，倒推出菌丝滤饼中两性霉素 B 总量。

1.2.2 干菌丝的制备
取滤饼 1000g，放入真空干燥箱中，45℃，-0.098MPa，12h；干燥结束后放于研磨中磨碎，过 40 目筛。

1.2.3 甲醇 - 氯化钙溶液的制备准确称取不同重量的氯化钙，将其缓慢放入 50ml 甲醇中，边加边搅拌，最后至氯化钙完全溶解，静置 2h，待用（氯化钙浓度为 5%，菌丝重与溶剂重之比为 5%的样品体积为150ml，用于分离工序）。

1.2.4 浸提
准确称取不同重量的干菌丝，放入甲醇 - 氯化钙溶液中，室温下搅拌 2h（机械搅拌，150r/min），取样检测其中两性霉素 B 浓度。

待检测的浸提液先稀释至合适浓度，用分光光度计进行检测。

1.2.5 分离
浸提结束，用布氏漏斗将菌丝滤除。

继续缓慢搅拌浸提液，并缓慢向浸提液中滴加适量的纯化水，至两性霉素 B 从浸提液中析出，离心分离（4000r/min，10min），并用适量丙酮洗涤，洗涤后仍用离心分离。

1.2.6 干燥
分离出的两性霉素 B 放入真空干燥箱进行干燥，45℃，-0.098MPa，6h。

1.2.7 分离后的两性霉素 B 的纯度检测干燥后的两性霉素 B 取出，称重，用高效液相色谱法[3]，检测其纯度。

2.1 菌丝中两性霉素 B 检测结果表 1：菌丝稀释液及标准对照稀释液紫外吸收数据从表 1 中数据看出，菌丝稀释液与标准对照稀释液的最大吸收峰相近，均在 404~405nm 之间，可见成分相近，两者的最大 Abs值也在线性区间内，每 100g 湿菌丝中含有两性霉素 B 重量为：0.1g/100 倍 /50 倍 *0.743/1.122*30 倍 *10 倍/0.1g*100g=
3.97g。

2.2 氯化钙浓度和菌丝投入量对抽提效果的影响待检测的浸提液稀释至浓度为 7~30ppm，用分光光度计进行检测，并计算出浸提液中两性霉素 B 的浓度。

改变氯化钙浓
本次研究，没有对氯化钙浓度、投粉量之间的关系做系统性的研究，可能在其他氯化钙浓度下、合适的投粉量，会有更好的浸提效果。

纯度虽然达到了中国药典要求，收率也较为满意，但通过改变干燥工艺、浸泡温度、调整更为合适的氯化钙浓度及投粉量、结晶方式，很可能会使纯度及收率有大幅提升。

甲醇 - 氯化钙溶液作为一种溶剂，在抗生素提炼中应用较少，但从实验中发现随着氯化钙浓度的变化，该溶剂性能也发生变化，并产生溶解抗生素的能力，从而实现了两性霉素 B 的分离纯化。

最佳的氯化钙浓度为 3%，最佳投粉量为15%，粗品含量 92.1%，总收率 41.8%。

该溶剂应用于两性霉素 B 的分离，甚至另外一种适合的化合物的分离，可以达到低成本、快速、高效、高纯度的分离效果。

参考文献
[1] 孙烈刚，用于化学热泵的氯化钙 /甲醇络合反应动力学的研究，[J]《计算机与应用化学》2003 年 06 期
[2] 曹蕊，紫外分光光度法测定两性霉素 B 的含量[J]，2007 年 05 期。

[3] 两性霉素 B 高效液相色谱检查法，中国药典[M]，2010。

[4] 两性霉素 B 质量标准，中国药典[M]，2010。

作者简介
张伟亮（1982-），男，助理工程师，主要从事化工医药生
产。