HPLC法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量
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桑叶采摘于安徽医科大学校园区，经安徽中医学院彭华 胜教授鉴定为桑科植物 Morus alba L． 的叶。分别取一定量的 鲜桑叶，于通风干燥处自然晾晒，干燥后称重得晒干样品; 置 真空干燥箱中，以 60℃ 的温度烘干，称重得烘干样品。 2 方法与结果 2． 1 色谱条件 色谱柱: Shim pack ODS 色谱柱( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ，柱温 35℃ ; 流动相 A: 0． 4% 磷酸乙腈溶液，B: 0． 4% 磷酸水溶液; 梯 度 洗 脱: 0 ～ 9 min A: 15% ，20 min A: 25% ，30 min A: 45% ，40 min A: 60% ; 检测波长 360 nm，流速 1． 0 ml·min － 1 ，进样量 20 μl。按照上述色谱条件进行测定， 结果显示芦丁、异槲皮苷和紫云英苷三种黄酮与其他共存峰 得到较好的分离，分离度均大于 1． 5，各成分理论塔板数均不 低于 3 000。 2． 2 对照品溶液配制 分别精密称取芦丁、异槲皮苷、紫云 英苷置 50 ml 棕色容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得 芦丁 0． 048 0 g · L － 1 、异槲皮苷 0． 107 4 g · L － 1 、紫 云 英 苷 0． 105 4 g·L － 1 的对照品贮备液。分 别 精 密 量 取 1． 0 ml 芦 丁、1． 0 ml 异槲皮苷、0． 5 ml 紫云英苷对照品溶液，置 10 ml 棕色容量瓶中，得到混合对照品溶液。 2． 3 供试品溶液制备 将晒干桑叶( 含水量 6． 3% ) 、60℃ 烘 干( 含水量 7． 5% ) 桑叶以及鲜桑叶( 含水量 68． 1% ) 分别于 粉碎机中粉碎，精密称取晒干桑叶粉末和烘干桑叶粉末各约 0． 2 g、鲜桑叶浆末约 4． 0 g，分别置于 100 ml 棕色容量瓶中， 加入甲醇 80 ml，超声 2 h，冷却至室温后，用甲醇定容至刻度， 过 0． 22 μm 微孔滤膜，作为三种桑叶的供试液。 2． 4 线性关系考察 将“2． 2”项下混合对照品溶液，用甲醇 逐级稀释成系列浓度的混合对照品溶液，分别进样 20 μl，以 峰面积为纵坐标，以对照品浓度( mg·L － 1 ) 为横坐标，绘制标 准曲线。结果芦丁的回归方程为 Y = 32 665． 7X － 12． 4 ( r = 0． 999 3) ，异槲皮苷的回归方程为 Y = 42 782． 5X － 260． 7( r = 0． 999 3) ，紫云英苷的回归方程为 Y = 55 208． 9X + 620． 1( r = 0． 999 9) ，其线性范围分别为 0． 076 ～ 1． 920，0． 086 ～ 2． 148 和 0． 042 ～ 2． 108 mg·L － 1 。 2． 5 稳定性实验 取晒干桑叶供试品溶液分别于 0，3，6，12 h 进样，进样体积 20 μl，记录峰面积，根据当天随行标准曲 线，计算样品各成分含量。样品中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷 含量的 RSD 分别为 2． 1% 、3． 0% 、2． 1% ，表明样品溶液在 12 h 内基本稳定。
( 1． Department of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230022，China; 2． School of Pharmacy，Anhui Key Laboratory of Bioactivity of Natural Products，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032，China)
［11］ Kanai T，Takayanagi K，Tanaka Y，et al． A practical preparation of ( Z) -2-( 5-amino-1，2，4-thiadiazol-3-yl ) -2-( methoxyimino ) acetic acid［J］． Tetrahedron Letters，1993，34( 40) : 6423 － 6．
Simultaneous determination of rutin，isoquercetin，
and astragalin in Mori Folium by HPLC
YAN An-ding1 ，YUAN Ye2 ，WU Liang2 ，MA Tao-tao2 ，XIE Jin2 ，ZHANG Qun-lin2
通讯作者: 张群林，女，博士，硕士生导师，研究方向: 药物色谱与光谱 分析研究，E-mail: qlzhang@ ahmu． edu． cn
菌［3］、降血脂［4］、抗肿瘤［5］ 等作用。桑叶的化学成分主要有 黄酮、生物碱、维生素以及多种人体所需的氨基酸，其中黄酮 类化 合 物 是 桑 叶 的 重 要 活 性 成 分［6］。 高 效 液 相 色 谱 法 ( HPLC) 测定酸水解后的桑叶中槲皮素及山柰酚含量［7］，以 及同时测定桑叶中绿原酸和芦丁的含量［8］ 已有报道。笔者 采用 HPLC 法分别测定晾晒、烘干及鲜桑叶中芦丁、异槲皮苷 和紫云英苷三种黄酮成分的含量，该法简便准确，重现性好， 不仅对选择桑叶药材加工方法的选择有指导作用，同时也可
［14］ 刘玉魁． 头孢菌素类抗生素 简介［J］． 中国 乡村医药，2006，13 ( 2) : 40 － 69．
［15］ 孙惠娟，张卫同，陈海滨． 头孢菌素类抗生素应用分析［J］． 中国 现代药学杂志，2006，16( 13) : 2059 － 61．
［16］ 傅德才，狄 蕊，李 彬． 头孢菌素类抗生素的研究进展［J］． 河 北师范大学学报: 自然科学版，2006，30( 6) : 693 － 7．
安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2011 Mar; 15( 3)
·297·
用于桑叶药材的质量控制。 1 仪器与试药 1． 1 仪器 高效液相色谱仪( LC-20，日本岛津公司) ，紫外 检测器; 电子天平( BP211D，德国 Sartarius) ; 超纯水机( MilliQ，美国 Millipore) ; 医用数控超声波清洗器( KQ-500E，昆山市 超声仪器有限公司) ; 中药粉碎机( 瑞安市永历制药机械有限 公司) ; 真空干燥箱( DZF-6050，上海新苗医疗器械制造有限 公司) 。 1． 2 试药 芦丁对照品( 中国药品与生物制品检定所，批号: 100080 － 200707) ，异槲皮苷对照品( 上海融禾医药科技发展 有限公司，批号: 100406) ，紫云英苷对照品( 上海融禾医药科 技发展 有 限 公 司，批 号: 100320 ) ，以 上 对 照 品 纯 度 均 大 于 98． 5% ( HPLC 法) ; 乙腈( 色谱纯) ，磷酸( 分析纯) ，甲醇( 分 析纯) 。
桑叶始载于《神农本草经》，为桑科植物桑 Morus alba L． 的干燥叶。本品性寒，味甘、苦，归肺、肝经，具有疏散风热、清 肺润燥、清肝明目的功能，常用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头 痛，目赤昏花［1］。近年来药理研究表明，桑叶具有抗凝［2］、抗
基金项目: 国家自然科学基金项目( No 30973674) ; 安徽省优秀青年科 技基金项目( No 10040606Y12)
230032)
摘要: 目的 建立晾晒、烘干及鲜桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量测定方法。方法 采用 HPLC 法，Shim pack ODS 色谱 柱( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ，柱温 35℃ ，流动相为 0． 4% 磷酸乙腈溶液( A) 和 0． 4% 磷酸水溶液( B) ，梯度洗脱，检测波长为 360 nm，流速设为 1． 0 ml·min － 1 。结果 三种黄酮类成分在 35 min 内达到良好分离，芦丁在 0． 076 ～ 1． 920 mg·L － 1 ，异槲皮苷 在 0． 086 ～ 2． 148 mg·L － 1 ，紫云英苷在 0． 042 ～ 2． 108 mg·L － 1 范围内线性关系良好( r ＞ 0． 999 3，n = 6) ，三种成分平均加样回 收率分别为 99． 7% ( RSD = 2． 5% ) 、98． 8% ( RSD = 2． 4% ) 和 99． 5% ( RSD = 4． 1% ) 。结论 该方法操作简单，结果准确，具有较 好的重复性和稳定性，为评价桑叶药材炮制方法提供了一个很好的依据，同时也可用于桑叶药材的质量控制。 关键词: 桑叶; 芦丁; 异槲皮苷; 紫云英苷; HPLC
［12］ 蒋银妹，罗秀琴，徐 燕． HPLC 测定注射用盐酸头孢唑兰的含 量及有关物质［J］． 华西药学杂志，2008，23( 4) : 468 － 9．
［13］ 张自义，粱宇翔，郝 兰，等． 7β-杂环酰胺基头孢菌素新衍生物 的半合成及抗菌活性研究［J］． 高等化学学报，1998，13 ( 9) : 914 － 7．
Abstract: Aim To establish an HPLC method for the simultaneous determination of rutin，isoquercetin and astragalin in Mori Folium by natural drying，toasting，and unprocessed． Methods A high-performance liquid chromatography equipped a Shim pack ODS( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm) column with UV detection used． The mobile phase consisited of 0． 4% phosphoric acid in acetonitrile( A) and 0． 4% phosphoric acid in water( B) with gradient elution． The column temperature was 35℃ ，and the flow rate was 1． 0 ml·min －1 ． The detection wavelength was set at 360 nm． Results The good saperation of three flavonoids was achieved within 35 min． Linear calibration curves were obtained with 0． 076 ～ 1． 920 mg·L － 1 for rutin，0． 086 ～ 2． 148 mg·L － 1 for isoquercetin，and 0． 042 ～ 2． 108 mg·L － 1 for astragalin，( r ＞ 0． 999 3) ． The average spiked recoveries of rutin，isoquercetin and astragalin were 99． 7% ( RSD = 2． 5% ) ，98． 8% ( RSD = 2． 4% ) ，and 99． 5% ( RSD = 4． 1% ) ，respectively． Conclusion The proposed method is simple，accurate，and repeatable，and can be used for quality control as well as a powerful tool to evaluate the processing of Mori Folium． Key words: Mori Folium; rutin; isoquercetin; astragalin; HPLC
［17］ 倪瑾莹． 头 孢 菌 素 类 药 物 比 较 及 应 用［J］． 检 验 医 学 与 临 床， 2007，4( 1) : 78 － 9．
［18］ 孙思 渺． 头 孢 类 杭 生 素 市 场 现 状 浅 谈［J］． 医 药 化 工，2006，5 ( 8) : 11 － 4． ( 收稿日期: 2010 － 09 －ui Medical and Pharmaceutical Journal 2011 Mar; 15( 3)
◇药物分析◇
HPLC 法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量
严安定1 ，袁 野2 ，吴 亮2 ，马陶陶2 ，谢 晋2 ，张群林2
( 1． 安徽医科大学第一附属医院药剂科，安徽 合肥 230022; 2． 安徽医科大学药学院，安徽天然药物活性研究省级重点实验室，安徽 合肥
( 1． Department of Pharmacy，The First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230022，China; 2． School of Pharmacy，Anhui Key Laboratory of Bioactivity of Natural Products，Anhui Medical University，Hefei，Anhui 230032，China)
［11］ Kanai T，Takayanagi K，Tanaka Y，et al． A practical preparation of ( Z) -2-( 5-amino-1，2，4-thiadiazol-3-yl ) -2-( methoxyimino ) acetic acid［J］． Tetrahedron Letters，1993，34( 40) : 6423 － 6．
Simultaneous determination of rutin，isoquercetin，
and astragalin in Mori Folium by HPLC
YAN An-ding1 ，YUAN Ye2 ，WU Liang2 ，MA Tao-tao2 ，XIE Jin2 ，ZHANG Qun-lin2
通讯作者: 张群林，女，博士，硕士生导师，研究方向: 药物色谱与光谱 分析研究，E-mail: qlzhang@ ahmu． edu． cn
菌［3］、降血脂［4］、抗肿瘤［5］ 等作用。桑叶的化学成分主要有 黄酮、生物碱、维生素以及多种人体所需的氨基酸，其中黄酮 类化 合 物 是 桑 叶 的 重 要 活 性 成 分［6］。 高 效 液 相 色 谱 法 ( HPLC) 测定酸水解后的桑叶中槲皮素及山柰酚含量［7］，以 及同时测定桑叶中绿原酸和芦丁的含量［8］ 已有报道。笔者 采用 HPLC 法分别测定晾晒、烘干及鲜桑叶中芦丁、异槲皮苷 和紫云英苷三种黄酮成分的含量，该法简便准确，重现性好， 不仅对选择桑叶药材加工方法的选择有指导作用，同时也可
［14］ 刘玉魁． 头孢菌素类抗生素 简介［J］． 中国 乡村医药，2006，13 ( 2) : 40 － 69．
［15］ 孙惠娟，张卫同，陈海滨． 头孢菌素类抗生素应用分析［J］． 中国 现代药学杂志，2006，16( 13) : 2059 － 61．
［16］ 傅德才，狄 蕊，李 彬． 头孢菌素类抗生素的研究进展［J］． 河 北师范大学学报: 自然科学版，2006，30( 6) : 693 － 7．
安 徽 医 药 Anhui Medical and Pharmaceutical Journal 2011 Mar; 15( 3)
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用于桑叶药材的质量控制。 1 仪器与试药 1． 1 仪器 高效液相色谱仪( LC-20，日本岛津公司) ，紫外 检测器; 电子天平( BP211D，德国 Sartarius) ; 超纯水机( MilliQ，美国 Millipore) ; 医用数控超声波清洗器( KQ-500E，昆山市 超声仪器有限公司) ; 中药粉碎机( 瑞安市永历制药机械有限 公司) ; 真空干燥箱( DZF-6050，上海新苗医疗器械制造有限 公司) 。 1． 2 试药 芦丁对照品( 中国药品与生物制品检定所，批号: 100080 － 200707) ，异槲皮苷对照品( 上海融禾医药科技发展 有限公司，批号: 100406) ，紫云英苷对照品( 上海融禾医药科 技发展 有 限 公 司，批 号: 100320 ) ，以 上 对 照 品 纯 度 均 大 于 98． 5% ( HPLC 法) ; 乙腈( 色谱纯) ，磷酸( 分析纯) ，甲醇( 分 析纯) 。
桑叶始载于《神农本草经》，为桑科植物桑 Morus alba L． 的干燥叶。本品性寒，味甘、苦，归肺、肝经，具有疏散风热、清 肺润燥、清肝明目的功能，常用于风热感冒，肺热燥咳，头晕头 痛，目赤昏花［1］。近年来药理研究表明，桑叶具有抗凝［2］、抗
基金项目: 国家自然科学基金项目( No 30973674) ; 安徽省优秀青年科 技基金项目( No 10040606Y12)
230032)
摘要: 目的 建立晾晒、烘干及鲜桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量测定方法。方法 采用 HPLC 法，Shim pack ODS 色谱 柱( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm) ，柱温 35℃ ，流动相为 0． 4% 磷酸乙腈溶液( A) 和 0． 4% 磷酸水溶液( B) ，梯度洗脱，检测波长为 360 nm，流速设为 1． 0 ml·min － 1 。结果 三种黄酮类成分在 35 min 内达到良好分离，芦丁在 0． 076 ～ 1． 920 mg·L － 1 ，异槲皮苷 在 0． 086 ～ 2． 148 mg·L － 1 ，紫云英苷在 0． 042 ～ 2． 108 mg·L － 1 范围内线性关系良好( r ＞ 0． 999 3，n = 6) ，三种成分平均加样回 收率分别为 99． 7% ( RSD = 2． 5% ) 、98． 8% ( RSD = 2． 4% ) 和 99． 5% ( RSD = 4． 1% ) 。结论 该方法操作简单，结果准确，具有较 好的重复性和稳定性，为评价桑叶药材炮制方法提供了一个很好的依据，同时也可用于桑叶药材的质量控制。 关键词: 桑叶; 芦丁; 异槲皮苷; 紫云英苷; HPLC
［12］ 蒋银妹，罗秀琴，徐 燕． HPLC 测定注射用盐酸头孢唑兰的含 量及有关物质［J］． 华西药学杂志，2008，23( 4) : 468 － 9．
［13］ 张自义，粱宇翔，郝 兰，等． 7β-杂环酰胺基头孢菌素新衍生物 的半合成及抗菌活性研究［J］． 高等化学学报，1998，13 ( 9) : 914 － 7．
Abstract: Aim To establish an HPLC method for the simultaneous determination of rutin，isoquercetin and astragalin in Mori Folium by natural drying，toasting，and unprocessed． Methods A high-performance liquid chromatography equipped a Shim pack ODS( 250 mm × 4． 6 mm，5 μm) column with UV detection used． The mobile phase consisited of 0． 4% phosphoric acid in acetonitrile( A) and 0． 4% phosphoric acid in water( B) with gradient elution． The column temperature was 35℃ ，and the flow rate was 1． 0 ml·min －1 ． The detection wavelength was set at 360 nm． Results The good saperation of three flavonoids was achieved within 35 min． Linear calibration curves were obtained with 0． 076 ～ 1． 920 mg·L － 1 for rutin，0． 086 ～ 2． 148 mg·L － 1 for isoquercetin，and 0． 042 ～ 2． 108 mg·L － 1 for astragalin，( r ＞ 0． 999 3) ． The average spiked recoveries of rutin，isoquercetin and astragalin were 99． 7% ( RSD = 2． 5% ) ，98． 8% ( RSD = 2． 4% ) ，and 99． 5% ( RSD = 4． 1% ) ，respectively． Conclusion The proposed method is simple，accurate，and repeatable，and can be used for quality control as well as a powerful tool to evaluate the processing of Mori Folium． Key words: Mori Folium; rutin; isoquercetin; astragalin; HPLC
［17］ 倪瑾莹． 头 孢 菌 素 类 药 物 比 较 及 应 用［J］． 检 验 医 学 与 临 床， 2007，4( 1) : 78 － 9．
［18］ 孙思 渺． 头 孢 类 杭 生 素 市 场 现 状 浅 谈［J］． 医 药 化 工，2006，5 ( 8) : 11 － 4． ( 收稿日期: 2010 － 09 －ui Medical and Pharmaceutical Journal 2011 Mar; 15( 3)
◇药物分析◇
HPLC 法同时测定桑叶中芦丁、异槲皮苷、紫云英苷的含量
严安定1 ，袁 野2 ，吴 亮2 ，马陶陶2 ，谢 晋2 ，张群林2
( 1． 安徽医科大学第一附属医院药剂科，安徽 合肥 230022; 2． 安徽医科大学药学院，安徽天然药物活性研究省级重点实验室，安徽 合肥