血管分析仪protocol

⾎管分析仪protocol
PowerLab⾎管分析仪---⼩⿏舒张功能
（四通道腔体浴槽+⼋通道记录仪+四通道桥式放⼤器+张⼒传感器）
⼀、准备⼯作：
1.配制Kreb’s营养液，KCl，PE，Ach，SNP溶液
1）Kreb’s液由六种钠盐或盐酸盐及葡萄糖构成：先将三种钠盐各⾃完全溶解混合配成10×母液1L（A液），三种盐酸盐各⾃完全溶解混合配成10×母液1L（B液），母液室温储存不要超过⼀周，以免盐析出使溶液浓度降低。

葡萄糖（Glucose·H2O）：称取1.10975g每包（⽤于1000mL⼯作液），称取⼗包置于封装袋内备⽤；0.55488g每包（⽤于500mL⼯作液），包装备⽤。

⼯作液：每天现⽤现配，A,B液各取100ml，加ddw700ml，加⼊1.10975g葡萄糖⼀包，转⼦搅拌均匀，边搅拌边加稀盐酸调节pH⾄7.2~7.4之间，再加⽔定容⾄1L.需要量增加时，所有液体各⾃扩⼤相应倍数获得。

⼀般做⼀天需要4-5L⼯作液。

2）KCl溶液（⽤于检测⾎管内⽪完整性）母液3.6M（称取2.6838gKCl配制10ml溶液）KCl终浓度为60mM，因加⼊浴槽后稀释100倍，应配浓度6M，但考虑KCl20℃下溶解度为34g/100g⽔，只能配制3.6M的KCl，使⽤时取150ul加⼊9ml溶液中。

3）PE：所需终浓度为10e-6M
详情：R-Phenylephrine Hydrochloride盐酸去氧肾上腺素---东京化成⼯业株式会社 5g 装，Mw=203.67
配制母液1M （即1mmol/ml,1ml溶液中203.67mg苯肾上腺素），依次倍⽐稀释得到⼯作液10e-4M。

4）ACh：所需累计浓度为10e-9~10e-5M
详情：Acetylcholine Chloride ⼄酰胆碱---sigma 25g装，Mw=181.67
配制母液1M，依次倍⽐稀释得到⼯作液10e-7~10e-3M
5）SNP：所需累计浓度为10e-9~10e-5M
详情：Sodium Nitroprusside硝普钠---Fluka
配制同⼄酰胆碱
2.解剖⽤具及材料
⼝罩，⼿套；
⼩剪⼑（直，弯），⼩镊⼦（直，弯），⽌⾎钳两把，显微解剖器械（显微剪&显微镊），蜡盘；10%甲醛溶液，75%酒精，棉球，PBS，⼩烧杯（倒⼊PBS清洗脏器），滤纸，marker笔，1.5EP 管，冻存管，包埋盒，冰盒，报纸，垃圾袋。

稀盐酸，⼲棉球
3.订混合⽓罐（95%氧⽓+5%⼆氧化碳）
⼆．操作
第⼀次开始实验的前⼀天做好以上准备⼯作，并将浴槽中的蒸馏⽔放出，换新⽔，每个腔室
浴槽⽤棉球蘸稀盐酸擦拭⼀次，再⽤蒸馏⽔冲洗三次，保证整个系统⽆可见污物，浴槽透明⼲净，刻度清晰。

精确称取1g（蔗糖+封装袋）作为标准砝码，开机，开电脑，打开LabChart软件，ctrl+Y 选择通道数为4，给每个张⼒换能器
定标，即将电压显⽰转换为重量显⽰（mV转换为g）。

量程最⼤为2g，并将此保存为“模板”⾄个⼈⽂件夹。

每次实验开始时，依次开机器，开电脑，打开“模板”⽂件，点击start，所有通道调零，开始机械平衡1⼩时；通氧⽓，调节浴槽内⽓泡⼤⼩；蜡盘倒⼊营养液4度预冷；配制所⽤Kreb’s⼯作液；平衡期间，数值（g）上下不超过0.03g就不要调，直到最后基线稳定。

同时开始解剖⼩⿏，摘眼球取⾎或断头处死后，⼩⿏背部擦酒精消毒，延着脊柱依次剪开⽪层，肌⾁层，和肋⾻，暴露胸腔，⽤⽌⾎钳打开胸腔，暴露胸主动脉（附着于脊柱上），DON’T TOUCH IT ⽤眼科剪眼科镊配合取下胸主动脉（尽量不要触碰它，千万不要伤害到它）马上放⼊含预冷Kreb’s液的蜡盘中，通氧⽓，摘去⼿套，徒⼿握显微剪显微镊剥离动脉周围结缔组织和脂肪组织等，得到⼀条光滑完整的动脉，显微剪剪开成3mm⼀条的动脉环，⽤不锈钢钩⼦（⽤华佗牌针灸针0.25mm制作）穿⼊动脉环，置于浴槽中，线另⼀端悬挂于张⼒换能器⾦属环上。

调节旋钮，使动脉的前负荷为0.5g。

平衡1h，期间只要数值上下不超过0.04g就不要进⾏⼤的调节，维持动脉的⽣理环境，同时注意氧⽓⽓泡⼤⼩要适宜。

平衡1h后，数值基本达到稳定状态，加KCl检测动脉内⽪完整性，刺激⾎管三次，分别洗掉，如果三次⾎管的收缩值⼀致，则说明⾎管内⽪完整性良好，再平衡30min开始正式实验。

平衡后，加PE终浓度为1uM，待⾎管收缩⾄坪值不再变化，依次加⼊累积浓度为10e-9~10e-5M的ACh，观察⾎管的舒张变化。

洗掉之后平衡20min，重新加⼊PE,改加SNP，观察⾎管的舒张变化。

三．收尾
实验结束后，⽓罐阀门关闭，浴槽中的营养液完全放出，以免盐分析出损伤机器。

⽤稀盐酸擦拭浴槽，并⽤蒸馏⽔冲洗⼲净。

⽼⿏⼫体收拾⼲净⼊垃圾袋送到实验动物中⼼，桌⾯⽤酒精擦拭⼲净。

解剖器械⽤⽔冲洗⼲净泡酒精，注意剪⼑夹缝中不要残留⾎迹！显微器械⼩⼼擦拭晾⼲并盖好保护帽，不要伤及剪⼑镊⼦的精细部分。