液相练习题

一、解释下列术语及缩写的含义
1. capacity factor
容量因子（capacity factor ）,也称分派容量（partition capcity ）或容量比（capcity ratio ），用k ′表示。

其概念为：在平衡状态下，溶质在固定相和流动相中分派量（质量或摩尔数）之比.
2. relative retention
相对保留值（relative retention ）也称分离因子（separation factor ）（α）它是必然色谱条件下一种物质与另一种物质的调整保留时刻或调整保留体积之比。

即
α=1
212R1R2R1R2k k K K V V t t ''==''='' （） 3. extra-column effect
柱外效应：即除柱内多种因素产生的色谱峰扩张外，其它产生峰扩张的因素之和：进样系统，系统连接管，检测器及其它柱外因素引发的峰扩张。

4. gradient elution
在HPLC 分析中，控制流动相组成或洗脱强度随时刻的改变而改变，以使极性不同较大的多个组分均能分离,同时谱峰距离较均匀，分析时刻尽可能短.此洗脱方式即梯度洗脱.
5. HPSEC
高效体积排阻色谱法,即以多孔性填料为固定相，依据样品组分分子体积大小的不同进行分离的液相色谱方式。

6. ODS
十八烷基键合硅胶，又称C 18. 典型的反相色谱柱，表面键和的基团为非极性羟基，适于分离弱极性，中等极性，较强极性及可电离的酸碱性有机物。

二、选择题（答案为一项或多项）
1.在色谱图上，两峰间距离决定于相应两组分在两相间的：A
A. 分派系数；
B.扩展效率；
C.理论塔板数；
D.理论塔板高度
2.在其他条件相同时，若理论塔板数增加一倍，两个临近峰的分离度将：C
A. 减少为原来的21；
B.增加1倍；
C.增加2倍；
D.增加22；
E.增加4倍
3.在气－液色谱中，第一流超卓谱柱的组分是： DE
A. 吸附能力小的；
B.脱附能力大的；
C.溶解能力大的；
D.挥发性大的；
E.溶解能力小的
4.固定液和组分分子间的作使劲有：
A. 静电力；
B.色散力；
C.氢键力；
D.诱导力；
E.化学键
在下列两种情形下，上述哪一种作使劲是主要的：
（1）用极性固定液分离极性组分时，分子间的作使劲主如果 A 。

（2）用极性固定液分离可极性化的非极性组分时，分子间的作使劲主如果 D 。

5. 有下列（1）、（2）两种检测器，在测定相对校正因子时，各选用下列哪个基准物质：
A. 丙酮；
B.无水乙醇；
C.苯；
D.环己烷；
E.正庚烷
（1）热导检测器用 C 。

（2）氢火焰离子化检测器用 E 。

6. 所谓检测器的线性范围是：BD
A.标准曲线成直线的范围；
B.检测器响应成线性时，最大和最小进样量之比；
C.检测器响应成线性时，最大和最小进样量之差；
D.最大允许进样量与最小检测量之比；
E.最大允许进样量与最小检测量之差；
7. 在液相色谱中，范氏方程中的哪一项对柱效能的影响能够忽略不计：B
A.涡流扩散项；
B.分子扩散项；
C.固定相传质阻力项；
D.流动的流动相中的传质阻力项；
E.停滞的流动相中的传质阻力项
8. 在液相色谱中，通用型的浓度检测器是：C
A. 紫外检测器；
B.荧光检测器；
C. 示差折光检测器；
D.电导检测器；
E.放射性检测器
9. 俄国植物学家茨维特（Tswett）用石油醚为洗脱液，分离植物叶子的色素是采用：B
A.液－液色谱法；
B.液－固吸附色谱法；
C.凝胶色谱法；
D.亲和色谱法；
E.离子色谱法
10. 反相色谱一般指：A
A.流动相为极性，固定相为非极性；
B.流动相为非极性，固定相为极性；
C.当组分流超卓谱柱后，又使其返回色谱柱入口；
D.流动相不动，移动固定相；
E.组分与流动相分子间有彼此作用，与固定相分子间无彼此作用。

三、填充题
1. 一个组分的色谱峰，其峰位置（即保留值）可用于定性分析，峰高或峰面积可用于定
量分析，峰宽可用于衡量柱效能。

2. 按照Van Deemter方程，推导出以A、B和C常数表示的最佳流速是B/C的平方根。

3. 各个色谱峰的保留值，反映了各组分在两相间的分派情形，它由色谱进程中的热力学因素所控制，各个色谱峰的半峰宽反映了各组分在色谱柱中的扩散情形，它由色谱进程中的动力学因素所控制。

4. 有效理论塔板数与理论塔板数之间的区别在于前者扣除色谱柱中死时刻的影响。

5. 涡流扩散项与填料粒度及填充均匀性有关。

6. 气相色谱中的柱温是一个重要的操作变数，它直接影响
分离效能和分析速度。

Pi）接近时，流速散布才比较均匀，7. 只有当柱前压与出口压力的比值（Po
柱效也最高。

8. 在有关反相柱性能的资料中，常常看到“封端”或“封尾”一词，其含义是将残余硅羟基进行硅烷化反映,以消除其对碱性物质的吸附作用,避免峰拖尾。

9. HPLC的键合相有许多种，试写出其中四种：
（1）氨基（2）氰基（3）二醇基(4) 烷基.
四、简答题
1.在进行HPLC分析时，为避免分析柱污染，一般应采取哪些办法？
1）．加一个保护柱（预柱），其固定相性质应与分离柱一样或相近。

2）．样品要尽可能净化，如沉淀蛋白，去除色素和无机盐等。

3). 样品分析结束后,应及时用适当溶剂清洗色谱柱.
2.乙醇的沸点为78.3℃，丁酮的沸点为79.6℃，在气相色谱柱上是不是必然是乙醇先出峰，丁酮后出峰，为何？
不必然.因为保留值除与样品组分的沸点有关外，还与样品及固定相的极性有关。

3.何谓反相离子对色谱？影响其保留值的因素主要有哪些？离子对试剂的链长和有机溶剂的比例如何影响保留值？
反相离子对色谱:在反相色谱流动相内加入“离子对”试剂,与样品中可电离的组份形成“对离子”(或叫“离子对”),在反相色谱柱上分离离子型化合物.
影响因素：1.介质：反相进程常常利用的的介质上以水为主体的缓冲溶液，其中pH值影响最大，PH则加倍阴离子的保留增加，阳离子则相反。

另外，缓冲液中离子类型和浓度也是重要选择性参数。

2.对离子浓度：增加反离子的浓度可增加保留，但这种关系并非是线性的
3有机改性剂：以水为主体的流动相中通常增加极性有机溶剂，如甲醇，乙月青等做改良剂，有机溶剂的加入改善了缔和分子在两相中的分派
4温度：它影响容量因子和离子化平衡的PK值
离子对试剂的链长越短，其稳固性就越差
有机溶剂的加入会影响原有缓冲溶液的PH值，另外对肽的离子化程度和缔和分子在两相中的分派起改善作用。

五、应用题
1.离子抑制色谱技术在食物分析中应用较广，请举出一实例说明其技术的原理，并写超卓谱条件和样品处置方式。

红葡萄酒中酚类化合物
样品预处置：将25ｍL红葡萄酒样品通过聚酰胺柱（259ｍｍ×.）,用5ｇPolgamid-6(Serva)装填，并先用的酸性水平衡），以100ｍL蒸馏水淋洗，再用150ｍL30％的甲醇（酸化至）洗脱，洗脱液真空浓缩至5ｍL左右，并用15％甲醇定容至10ｍL。

色谱柱：ODS柱（125mm×.,），室温
流动相：体积比为85:15的水－甲醇（用HClO3调）
流速：min 检测：UV-280nm 样品：红葡萄酒
原理:离子型化合物在反相色谱柱上不保留,改变流动相的pH值，抑制样品离子的电离,使其成为电中性分子.
2.请设计出测定某一多糖样品的分子量散布或单糖组成的色谱分析方式（包括样品处置方式和色谱条件）。

高效液相色谱法测定果汁的糖类组分含量
一、标准溶液系列配制
别离准确称取各类糖标准品100mg左右于10ml容量瓶中，用超纯水溶解定容摇匀后，即得10mg/ｍＬ左右的标准溶液，再以此逐级稀释成8mg/mＬ, 6mg/mＬ, 4mg/mＬ, 2mg/mＬ, 1mg/mＬ的标准溶液系列，均经μm微孔膜过滤，滤液供进样用。

二、样品处置
准确量取3ml果汁至10ml容量瓶顶用无水乙醇定容至刻度，离心后取上清液在热水浴条件下用氮气将乙醇吹去，再用水定容，并用有机相微孔膜过滤，滤液颜色若较深，再用Sep-Pak C18固相萃取小柱处置去除色素等杂质，处置后的样液上机测定。

3、上机测定
补充:
一、色谱法分离原理是基于不同组分在固定相和流动相之间分派系数
不同。

气相色谱主要用于分析沸点较低的物质，而高效液相色谱主要用于分析沸点较高的物质。

二、高效液相色谱的分离模式主要有：正相，反相，离子互换色谱，凝胶过滤色谱；分析单糖或低聚糖主要采用正相色谱、体积排阻色谱和配位互换色谱分
离模式;利用的色谱柱主要有氨基柱和阳离子互换柱，流动相别离为乙腈/水和 纯水 。

3、高效液相色谱检测糖常利用 示差折光 检测器和 蒸发光散射 检测器。

4、HPLC 分析肽分子量散布可利用的色谱柱为： 硅胶基质凝胶柱,如TSKgel G2000SW XL ， 流动相为：乙腈（或异丙醇及甲醇）/水/三氟乙酸（乙腈为10～45％，三氟乙酸一般为％），检测波长为 220nm 。

5、请简述检测果酒或黄酒中的中性酚和酸性酚的样品处置方式和色谱条件(选用什么色谱柱和流动相及检测器?检测波长大致多少nm)。

第五题第一个。

称取必然量的酚类物质，溶于少量水，在棕色容量瓶中定容至10 mL ，浓度别离为：儿茶素 mg/L ，绿原酸 mg/L ，咖啡酸 mg/L ，表儿茶素 mg/L ，香豆酸 mg/L ，阿魏酸 mg/L ，摇匀，放入冰箱4°C 避光贮存备用。

配制标准溶液时，采用逐级稀释法配成一系列浓度的混合标准溶液。

取25 mL 原料用1 mol/L NaOH 溶液调pH 值至，加入25 mL 乙酸乙酯，用混合摇床震荡10 min ，然后转移到分液漏斗中分离，水相再用25 mL 乙酸乙酯萃取1次，归并酯相为中性酚。

水相再用6 mol/L 的HCl 溶液调pH 值至，再别离用25 mL 乙酸乙酯萃取2次，归并酯相为酸性酚。

将中性酚和酸性酚归并后浓缩至干，残渣溶于水中，并在棕色容量瓶中定容至25 mL ，用 μm 滤膜过滤，滤液于冰箱4℃贮存待测。

色谱柱：Eclipse XDB C １8 (150 mm ×4.6 mm i ．d ．， 5 μm)，流动相：A 为甲醇；B 为1％乙酸水溶液 (V/V)；梯度洗脱程序：溶剂A 在40 min 内由5％上升到 30％，然后变成100％，并维持 5 min ，最后再返回到初始状态。

柱温：30℃；流速： mL/min 光电二极管阵列检测器；检测波长：280 nm ；进样量：20 μL 。

六、在HPLC 分析中常常利用的定量方式有外标法、内标法，归一化法，标准加入法。

归一化方式利用的前提条件是什么?
归一化方式利用的前提条件：样品中所有成份都要能从色谱柱上洗脱下来，并能被检测器检测，检测响应因子要相等或相近。

7.分析多糖或多肽的分子量散布应采用何种色谱分离模式?请简述该色谱模式的大体原理.
高效凝胶过滤色谱（HPGFC ）分析，高效凝胶过滤色谱法（HPGFC ）的特点是：多糖按分子量大小洗脱，凝胶色谱柱的选择主要取决于被分离样品的性质和糖组分分子量大小，以凝胶过滤色谱分析多糖的流动相一般为盐溶液。

8.对于HPLC ,影响分离度的k ′、α、N 三要素别离与哪些色谱条件有关?
⎪⎪⎭
⎫ ⎝⎛⎪⎭⎫ ⎝⎛-⎪⎭⎫ ⎝⎛+=411 ' 'N k k R αα
● k ´ 与流动相组成(主如果溶剂比例、pH 等)、固定相的性质和用量及柱温有关。

● α由流动相组成(专门是有机溶剂种类和pH 值等)、固定相的性质及柱温等因素决
定。

● N （或H ）由板高方程各项参数决定，一般随色谱柱长、填料粒径、填充均匀度、流
速和温度等操作条件的转变而变。

计算题 : 若在一气相色谱图上,测得保留时刻t R =5.37cm,死时刻t m =0.52cm,峰底宽w=1.32cm,假定柱长为1m,计算:
(1) 理论塔板数和有效理论塔板数.
(2) 塔板高度及有效塔板高度
(3) 分派比 （（1）265，216（2）3.77mm,4.63mm （3） ） 注：N=(h/2
R w t )2=16(w t R )2 式中W h/2和W 别离为半顶峰宽和峰底宽。

按照色谱柱长L 和理论塔板数N ，可求出每一个塔板高度H ：
H=L/N
为了清除色谱柱中死体积对柱效的影响，人们常常利用有效理论塔板数(N eff )表征色谱柱的实际柱效：
N eff =16(w t R ')2 = (h/2
R w t ')2 t R ′ =t R - t m 相应的有效理论塔板高度为: H eff =
eff N L k=(t R -t m )/t m。