miRNA—26a在良、恶性腹水鉴别诊断中的意义

miRNA—26a在良、恶性腹水鉴别诊断中的意义目的探讨miRNA-26a在良、恶性腹水鉴别诊断中的意义。

方法收集北
京大学深圳医院2011年9月～2014年3月门诊及住院患者60例，包括20例肝硬化腹水患者（肝硬化腹水组），20例结核性腹水患者（结核性腹水组），20例恶性腹水患者（恶性腹水组）。

采用实时定量PCR（qRT-PCR）方法检测并比较各组血清miRNA-26a、甲胎蛋白（AFP）、糖类抗原125（CA125）的表达。

结果恶性腹水组血清CA125表达高于结核性腹水组和肝硬化腹水组，但差异无统计学意义（P > 0.05）。

AFP、miRNA-26a在结核性腹水组及肝硬化腹水组表达差异无统计学意义（P > 0.05）；AFP和miRNA-26a在恶性腹水组患者血清表达明显高于结核性腹水组和肝硬化腹水组，差异有统计学意义（P 0.05）. The differences of AFP，miRNA-26a between tuberculous ascites group and hepatic cirrhosis ascites group was not statistically significant （P > 0.05）；the AFP，miRNA-26a in malignant ascites group were all higher than those in hepatic cirrhosis ascites group and tuberculous ascites group，the differences were statistically significant （P 0.05），具有可比性。

1.2 纳入和排除标准
①乙肝肝硬化腹水患者纳入和排除标准：具有慢性乙型病毒性肝炎病史，或伴有门静脉高压，肝功能减退表现；影象学检查，如CT、B超或MRI检查支持肝硬化的诊断，排除其他各种原因引起的肝硬化，如酒精性肝硬化、血吸虫性肝硬化、Wilson病、胆汁淤积性肝硬化等，排除合并其他严重的器质性疾病，如合并心功能衰竭、肾功能衰竭、呼吸功能衰竭、恶性肿瘤等。

②结核性腹水患者纳入和排除标准：根据患者结核病史、临床症状、体征、腹水常规和腹水细胞学、其他化验结果，以及参照可能的PPD皮试阳性，腹水或痰涂片抗酸染色阳性以及影象学结果能够临床明确诊断的结核性腹水患者；通过正规四联抗结核治疗2周以上有效；或腹膜病理活检确诊，排除其他原因引起的腹水，排除合并其他严重器质性疾病。

③恶性腹水患者纳入和排除标准：临床表现符合，且影像学如B 超、CT、MRI、PET-CT提示患者有恶性肿瘤且合并腹水；胃肠镜、腹腔镜、腹水细胞学或手术病理确诊恶性肿瘤的腹水患者，排除其他严重性器质性疾病和其他原因引起的腹水。

本研究经过医院伦理委员会通过。

1.3 方法
1.3.1 标本的采集和处理获得血液标本之后，将其静置，等待血液凝固后析出血清，之后吸取上层液体和抗凝血液样本，5000 r/min，离心半径10 cm，离心12 min，提取上清液。

1.3.2 肿瘤标志物检测血清样本中甲胎蛋白（AFP），糖类抗原125（CA125）等浓度采用化学发光分析法进行测定，由我院检验科进行检测。

试剂盒由天津市协和医药科技有限公司提供。

1.3.3 miRNA26a的检测采用常规qRT-PCR方法检测方法，主要包括以下步骤：①总RNA提取，根据RNA提取试剂盒完成；②总RNA纯度和完整性检测；
③逆转录；④定量PCR。

大致具体过程如下：在采血后的6 h内，分别吸取200 μL血浆，使用miRcute miRNA提取试剂盒的操作方法，进行miRNA的提取。

完成后，吸取11 μL的miRNA提取液，37℃反应1 h加多聚腺苷酸，然后吸取2 μL反应液37℃反应1 h进行cDNA的合成。

上述完成后，采用实时定量PCR的方法，检测miRNA-26a的表达情况；采用20 μL的反应体系，每孔加入5 μL的cDNA，0.5 μL上游引物和下游引物，10 μL 2X stbr greenpcr master mix，6.5 μL 的双蒸水。

反应条件如下：94 ℃反应1 min，94℃反应15 s，60℃反应30 s退火，72℃反应30 s延伸，反应进行42个循环。

其中定量PCR用酶（SYBR Green PCR Master Mix）购自TOYOBO公司。

1.4 统计学方法
采用统计软件SPSS 13.0对数据进行分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用方差分析，两两比较采用LSD-t检验。

计数资料以率表示，采用χ2检验。

以P 0.05）。

AFP、miRNA-26a在结核性腹水组及肝硬化腹水组表达差异无统计学意义（P > 0.05）；AFP和miRNA-26a在恶性腹水组患者血清表达明显高于结核性腹水组和肝硬化腹水组，差异有统计学意义（P 0.05）。

癌性腹水患者血清检测提示AFP、CA125高于正常值比例分别为40%、45%；以0.025作为参考值，miRNA-26a高于0.025的比例为45%，在结核性腹水患者血清中AFP、CA125高于正常值比例分别为0%、55%，miRNA-26a高于0.025的比例为10%；在肝硬化腹水患者血清中，AFP、CA125高于正常值比例分别为15%、50%，miRNA-26a高于0.025的比例为10%。

表1 AFP、CA125、miRNA-26a在各组血清中表达情况（x±s）
注：与恶性腹水组比较，*P < 0.05；AFP：甲胎蛋白；CA125：糖类抗原125
3 讨论
相对过去，近年来腹水的诊断变得越来越容易，主要是原因是影像学技术的不断发展，比如CT、MRI、PET-CT等。

此外，一些血清和腹水的标志物检测也对诊断提供了一些帮助。

如果仍无法明确诊断的，还可以最终采用腹腔镜等方式探查腹腔，帮助明确诊断。

但是即使如此，临床上仍然有少部分腹水患者诊断不清，部分是因担心手术风险，拒绝腹腔镜检查，或因为身体状况不佳，无法承受腹腔镜检查，还有极少部分患者即使行腹腔镜检查，仍然无法找到原因。

而传统的血清学标志物如肿瘤标志物等的检测，似乎对此类患者也束手无策。

在一些研究中认为AFP和CA125有助于良、恶性胸腹水的诊断。

AFP被多数研究认为是到目前为止原发性肝细胞癌的最为灵敏和特性的肿瘤指标。

CA125是一种高分子质量糖类抗原，其被认为是妇科肿瘤，特别是卵巢癌的最重要的血清学标志物之一，同时可在其他多种肿瘤和良性疾病中升[4-6]。

本研究观察到
AFP在恶性腹水患者血清中的表达水平和高于正常值的比例明显高于良性腹水组（包括结核性腹水和肝硬化腹水组），提示AFP的确有利于良恶性腹水的诊断，但AFP作为腹水鉴别的标志物时有明显缺陷，考虑到本研究中肝癌患者高达8例，如果剔除这些入组的肝癌患者，其他恶性腹水患者AFP水平和升高比例与良性腹水主相比，没有明显统计学差异。

因此AFP在研究中是否能帮助腹水的鉴别诊断，可能取决于入组的肝癌患者的比例和数量。

本研究中发现CA125的表达水平在恶性腹水患者中较高，但与其他组相比没有统计学意义。

可能原因是本次研究中，入组的妇科肿瘤患者比例少有关，因为CA125在婦科肿瘤中升高更为明显。

由此可见，尽管这些肿瘤标志物对诊断有帮助，但似乎帮助有一定限制，因此，有必要寻找一种新的血清学标志物来帮助腹水患者的诊断。

非编码RNA研究是生物医学领域近年来，可与人类基因组计划相提并论的重大成果之一[1-2]。

miRNA是近年新发现的非编码RNA的一种，它广泛存在于真核生物中，在物种之间具有系统进化上的高度保守性、时序性和组织特异性。

它与多种生物学过程密切相关，包括发育、细胞分化、增殖、凋亡、病毒感染和肿瘤发生和发展等[2]。

miRNA能影响基因表达的主要机制是：通过与靶基因的基因非编码区特异性的碱基配对导致其降解或翻译阻遏，从而对基因进行转录后的调控[2]。

已有研究表明，miRNA与肿瘤发生密切相关，miRNA一部分可能调节肿瘤细胞的增殖和存活，促进肿瘤的生长和侵袭，另一部分可能参与抑制肿瘤细胞生长。

miRNA将来可能作为一个肿瘤监测指标和治疗靶点已为多数人认可[7-9]。

本研究发现miRNA-26a在恶性腹水患者血清的表达明显高于在结核性腹水和肝硬化腹水患者，这提示miRNA-26a水平有可能帮助良，恶性腹水的鉴别诊断。

尽管关于miRNA-26a的文献不多，但它被认为是一种与肿瘤密切相关的非编码RNA。

miRNA-26a可能作为一种肿瘤抑制因子，显著降低裸鼠在肝肿瘤负荷。

miRNA-26a可以通过依赖和非依赖于细胞周期蛋白途径来抑制肝癌细胞生长[10]。

高表达的miRNA-26a的乳腺癌患者对他莫昔芬（抗肿瘤药物）反应较好[11]。

miRNA-26a还可以通用不同途径EZH2抑制鼻咽癌细胞生长[12]。

这些提示miRNA-26a的变化与肿瘤疾病的发生存在一定相关性，但miRNA-26a如何参与肿瘤发生，发展的机制仍不明确。

虽然本研究观察到miRNA-26a在恶性腹水患者血清的表达有升高，但目前尚不清楚miRNA-26a在恶性腹水患者血清的表达明显升高的原因，也不清楚其是否参与了肿瘤的发生和发展过程。

由于缺乏相关大规模研究和以及试剂和相关方法的影响，无法确定miRNA-26a正常值范围，尚无法运用于临床，但是随着进一步研究的深入，联合运用miRNA-26a和其他肿瘤标志物进行检查，帮助腹水的鉴别诊断，将成为可能。

下一步，将研究良、恶性腹水患者血清miRNA-26a 升高的可能机制。

[参考文献]
[1] Guarnieri DJ，DiLeone RJ. MicroRNAs：a new class of gene regulators [J]. Ann Med，2008，40（3）：197-208.
[2] Jiang X，Tsitsiou E，Herrick SE，et al. MicroRNAs and the regulation of fibrosis [J]. FEBS J，2010，277（9）：2015-2021.
[3] Baek D，Villen J，Shin C，et al. The impact of microRNAs on protein output [J]. Nature，2008，455（7209）：64-71.
[4] 李学文，肖创清.肝硬化患者血清及腹水中CA199，CA125和CA153的临床意义[J].中国现代医学杂志，2006，16（24）：188-189.
[5] 单国栋，金恩芸，杨铭，等.CA125与腺苷脱氨酶在结核性腹膜炎患者中的临床意义[J].中华内科杂志，2006，45（23）：938-939.
[6] 李曦，邹兵.结核性腹水和恶性腹水的鉴别[J].中外医学研究，2010，8（2）：22-23.
[7] Zhang X，Chen C，Wu M，et al. Plasma microRNA profile as a predictor of early virological response to interferon treatment in chronic hepatitis B patients [J]. Antivir Ther，2012，17（7）：1243-1253.
[8] Banaudha KK，Verma M. The Role of MicroRNAs in the Management of Liver Cancer [J]. Methods Mol Bio，2012，863：241-251.
[9] Fang Y，Fang D，Hu J. MicroRNA and its roles in esophageal cancer [J]. Med Sci Monit，2012，18（3）：22-30.
[10] Chen L，Zheng J，Zhang Y，et al. Tumor-specific expression of microRNA-26a suppresses human hepatocellularcarcinoma growth via cyclin-dependent and -independent pathways [J]. Mol Ther，2011，19（8）：1521-1528.
[11] Jansen MP，Reijm EA，Sieuwerts AM，et al. High miR-26a and low CDC2 levels associate with decreased EZH2 expression and with favorable outcome on tamoxifen in metastatic breast cancer [J]. Breast Cancer Res Treat，2012，133（3）：937-947.
[12] Alajez NM，Shi W，Hui AB，et al. Enhancer of Zeste homolog 2（EZH2）is overexpressed in recurrent nasopharyngeal carcinoma and is regulated by miR-26a，miR-101，and miR-98 [J]. Cell Death Dis，2010，1：e85.。