CMVpp65基因修饰的树突状细胞刺激自身T细胞活化

文章编号(Article ID): 1009- 2137(2008)02- 0397- 04 # 论著# CMV pp65基因修饰的树突状细胞刺激自身T细胞活化
高广勋, 陈协群, 张劲翼1, 朱华锋, 董宝侠, 顾宏涛, 高瑛, 潘耀柱第四军医大学西京医院血液科, 陕西西安, 710032, 1 多伦多大学西奈山医院Samuel Leunenfeld研究所, 加拿大
摘要巨细胞病毒(CMV )感染易发生于慢性移植物抗宿主病( cGVHD )患者, 其特异性免疫依赖于T 细胞活性。

本研究探讨CMV pp65基因修饰的树突状细胞(DC )对自身T 细胞的活化作用。

采用具有高效转染非分裂细胞的慢病毒系统将CMV 全长pp65基因导入鼠源性DC; 采用CpG-DNA 诱导DC细胞成熟; 采用流式细胞术及免疫荧光方法测定T淋巴细胞抗原及IFNC?表达。

结果表明: 慢病毒感染DC的感染复数(m ultiplicity of infection, M O I)为50, 最佳感染效率可达30% - 40% ; 表达pp65基因的成熟DC能刺激自身naive T 细胞表达CD69; 表达PP65蛋白的成熟DC能够刺激自身CD4+ 或CD8+ T 细胞分泌IFNC。

结论: pp65基因修饰、C pG-DNA 诱导成熟的DC能体外激活CM V 特异性T 淋巴细胞。

关键词巨细胞病毒; PP65蛋白; T淋巴细胞; 树突状细胞; C pG-DNA 中图分类号Q 813; R392 文献标识码 A
CMV pp65 GeneM odified Dendritic CellsActivate AutologousT Cells GAO G uang-Xun, CHEN Xie-Q un, ZHANG Jin-Yi1, ZHU Hua-Feng, DONG Bao-Xia, GU Hong-Tao, GAO Ying, PAN
Yao-Zhu D epartment o fHematology, Xijing Ho spita l, The Fourth M ilitary M edical University, X i. an 710032, Shanxi Province, China; 1The Samuel Lunenfeld Resea rch Institute, M ount Sina iHo spita l, U niversity of Toronto, Toronto, Onta rio, Canada Abstract Cytom egalov irus (CM V ) infection is a dangerous complication in patientsw ith chronic graft versus host disease ( cGVHD). CMV-specific imm unity depends on the activ ity of T cells. This study w as ami ed to investigate the effect of CMV pp65 gene m odified dendritic cells (DC s) on activation of auto logous T cells. Lentivirus system w as utilized to introduce the CMV ful-llength pp65 gene into m ouse DC s; CpG-DNA w as used to inducem ature DC s; flow cytom etry and immuno fluorescence were used to determ ine the expression of antigen and IFNC in T lym phocytes. The results show ed that the DC s w ere infected w ith lentivirus at a m ultiplicity of infection ( MO I) of 50 w ith optmi al infectious efficiency of 30% - 40% ; m ature DC s expressing pp65 gene could stim ulate autologous naive T cells to expressCD 69 specifically; m ature DC s expressing PP65 could stim ulate autologousCD4+ or CD 8+ T cells to produce IFNC . It is concluded that CMV pp65-m odified and CpG-DNA-induced mature DCs can activate CMV- specific T lymphocytes in vitro. Key words cytom egalovirus; PP65 protein; T lym phocyte; dendritic cel;l C pG-DNA J ExpH em
atol 2008; 16( 2): 397- 400
巨细胞病毒( CMV )感染易发生于慢性移植物抗宿主病( cGVHD )等免疫功能低下患者, 而CMV 免疫依赖于T 细胞活性, 因此恢复CMV 特异性T 淋巴细胞功能对于防治CMV 感染就尤为重要。

树突状细胞( dendritic cells, DC) 是目前已知机体内功能最强的专职性抗原呈递细胞, 其最大特点是能够显著刺激初始型T 细胞( naive T cell) 增殖及成熟,是机体免疫反应的始动者[ 1- 3]。

本研究旨在通过构建表达CMV PP65蛋白的慢病毒( lentivirus)表达载体PLL3. 7- pp65, 并将其转入小鼠骨髓细胞来源的DC, 进而观察表达pp65并经CpG-DNA诱导成熟的DC 对自身naive T 的体外活化作用及对
CD4+ 、CD8+ T 细胞分泌IFNC的影响, 从而为今后采用DC 疫苗防治cGVHD 患者的CMV 疾病提供体外实验依据。

材料和方法
试剂慢病毒表达载体PLL3. 7-pp65及293FT 细胞系(人胚肾细胞系)由加拿大多伦多大学Sam uelLeunenfeld
基金项目: 国家自然科学基金资助项目, 编号30370599 通讯作者: 陈协群, 教授、主任医师、博士生导师. 电话: ( 029 ) 84775199. E-mai:l x iequnchen@ sina. com 2007- 05- 29收稿; 2007- 11- 01接受
#397#中国实验血液学杂志Journal ofExperim entalH em ato logy
2008; 16( 2): 397- 400
研究所张劲翼博士惠赠。

包装质粒( pLP1、PLP2和pLP /VSVG )、lipofectam ine 2000TM 购于美国Invitrogen 公司。

ant-iCD11c M icroBeads、ant-iCD 62L M icro Beads购自M iltenyi Biotec公司, CD 4+ 、CD 8+ T 细胞分离柱购自加拿大Cedarlane公司, DMEM、O pt-i M EM I和RPM I 1640培养液、胎牛血清( FCS)、非必需氨基酸购于G ibco 公司, Brefeldin A 购自Sigm a 公司, GM-CSF 购自R&D 公司, FITC 标记的CD 4、CD 8、CD 86和PE标记的CD 1b、IFN-C单克隆抗体均购自美国Becton D ickinson 公司。

CpG- DNA 1826[ 4]合成由Inv itrogen公司完成。

实验用小鼠由本校动物培养中心提供。

小鼠骨髓来源DC 的体外培养[5] 无菌取C57BL /6小鼠股骨, 浸入70% 的乙醇中1分钟, 用PBS清洗2遍, 置于RPM I 1640培养液中, 将股骨两端剪开, 用2m lRPM I 1640培养液冲洗骨髓腔, 用0. 83% NH4C l裂解红细胞, 分离出单个核细胞。

骨髓单个核细胞置于含100 ng /m l 鼠GM- CSF、10% FCS 的RPM I 1640培养液中, 在37e 、5% CO2、饱和湿度条件下培养, 第3和第6天半量更换含100 ng /m l鼠GM-CSF的培养液, 第8天后, 骨髓基质细胞层上生长出大量DC 簇。

培养DC的纯化及成熟诱导将上述方法培养的DC, 经ant-iCD 11c M icroBeads 分离、纯化后, 即可获得高纯度的DC,
具体操作方法见说明书。

分离纯化的幼稚DC 加入CpG-DNA 1826 ( 1 Lg /m l) [ 4], 培养48小时, FITC 标记的CD 86和PE 标记的I-Ab 单克隆抗体标记后流式细胞仪检测其膜成熟标志CD 86、I-Ab 抗原表达。

PLL3 . 7-pp65重组慢病毒的制备将3 Lg PLL3. 7-pp65重组表达载体与9 Lg包装质粒混合, 在lipofectam ine 2000的介导下转染培养于O pt-iM EM I培养液中的6 @ 106 个293FT 细胞。

孵育12小时后, 换为含 1 mm ol/L 丙酮酸钠的完全DMEM, 培养72小时, 经15 00 @g 离心15分钟, 取上清, 并经0. 45 Lm 滤器过滤后, 病毒上清采用25 000 @g 离心2小时浓缩, 病毒浓缩液保存于- 80e 备用, 浓缩病毒滴度达 2 @ 109 感染单位( IFU ) /m l。

DC对自身naive T细胞的刺激取C57BL /6小鼠脾脏, 剪碎后筛网过滤制成单细胞悬液, 以0. 83% NH4C l裂解红细胞; 经T 细胞分离
柱分离全T细胞; 使用ant-iCD 62L M icroBeads从已经分离的T 细胞中纯化阳性表达CD 62L 的naive T 细胞, 操作方法见试剂盒说明书。

试验分为3组。

A组: 单纯培养DC组; B组: 转染PLL3. 7-pp65 DC 组; C 组: 转染PLL3. 7-pp65 DC 联合CpG-DNA ( 1 Lg /m l)组。

各组DC 均按1B10比例与naive T 细胞在含GM-CSF ( 50 ng /m l)的培养液中共孵育48 小时, 用流式细胞仪检测活化抗原CD69阳性率。

实验重复3次。

分泌INFCCD4+、CD8+ T细胞的测定[ 7] DC分别按1B1比例与经上述方法分离的T 细胞混合, 培养液中含IL-2 20 U /m ,l 共孵育2小时后加B refeldin A ( 8 Lg /m l)阻断靶细胞蛋白分泌, 细胞继续孵育6小时, 对细胞内细胞因子进行染色: 处理细胞用FITC 标记的CD 4和CD 8单克隆抗体染色20分钟, 2% 多聚甲醛固定20分钟, 0. 3% T ritonX- 100透化处理3分钟, PE 标记ant-iIFN-C单克隆抗体标记细胞内IFN-C15分钟, 用流式细胞仪检测CD4+ 和CD 8+ T 细胞表达IFNC的阳性率。

统计学处理用SPSS 11. 0软件进行统计处理, 实验数据以均数?标准差表示, 采用t 检验分析实验组和对照组之间的差异。

结果
CpG-DNA对DC的成熟诱导作用小鼠的骨髓细胞中已鉴定出DC 的造血祖细胞克隆, 它在GM-CSF培养下能分化成DC。

骨髓单个核细胞置于含100 ng /m l鼠GM-CSF 的培养液中, 7 - 8天后, 骨髓基质细胞层上生长出大量DC 簇。

经ant-iCD 11c M icroBeads分离、纯化后, 每只小鼠最终可获2 @ 106 个DC, 纯化的幼稚DC 经CpG- DNA 1826 ( 1 Lg /m l) 刺激48小时后, 其形态、功能趋于成熟, 表现为细胞星状突起增多, 膜CD 86、I-Ab 表达明显上调(图1)。

重组慢病毒pp65载体转染DC及其效率取感染复数( multiplicity of infection, MO I)值为50 的慢病毒表达载体
PLL3. 7-pp65与6 @ 106 个DC 共孵育48- 72小时(总体积1- 1. 5m l), 用流式细胞仪测定EGFP阳性表达率可达30% - 40% (图2B)。

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表达pp65 DC对自身naive T细胞的活化作用将转染PLL3. 7-pp65 表达载体的DC 按比例与naive T 细胞共孵育2天( 50 ng /m lGM-CSF), 流式细胞仪检测转染PLL3. 7-pp65 DC 组( B组)活化抗原CD 69阳性率为( 30 ? 2. 5)%, 明显高于未处理DC组[ A 组, ( 4 ? 1. 3)% , p < 0. 01]; 辅以CpG- DNA 刺激后, CD 69阳性率则升至( 45 ? 4. 6)% ( C 组), 均明显高于PLL3. 7-pp65 DC 组( B 组, p < 0. 01)和未处理DC组( A组, p < 0. 01)。

Figure 1 . Expression of CD86 and I-Ab on DCs stimulated by CpG-DNA. A: DC unstmiulated . B: DC exposured to 1Lg/m lCpG-DNA 1826 for 48 hours.
Figure 2 . Expression of EGFP in PLL3 . 7-pp65 trans- fected DC. A: DC untransfected. B: DC transfected w ith PLL3. 7-pp65.
表达pp65 DC对自身CD4+、CD8+ T细胞分泌INFC的影响表达pp65DC 细胞按比例与T 细胞共孵育2小时, 然后加Brefeldin A阻断靶细胞蛋白分泌, 继续将细胞孵育6小时, 常规免疫荧光染色, 流式细胞仪检测表达PP65DC刺激的CD 4+ T 细胞胞浆内IFNC阳性率[ ( 6. 7 ? 0. 9)% , 图3A ]较感染空
载体PLL3. 7 的DC组[ ( 1. 5 ? 0. 5)% , 图3B ]和未修饰DC 组[ ( 1. 3 ? 0. 7)% , 图3C]显著增加( p < 0. 01 )。

表达PP65 DC 刺激的CD8+ T细胞胞浆内IFNC阳性率[ ( 7. 1 ? 0. 9)% , 图3D ]较感染空载体PLL3. 7
DC组[ ( 1. 2 ? 0. 5)%, 图3E] 和未修饰DC 组[ ( 019? 0. 3)%, 图3F]显著增加(p< 0. 01)。

F igure 3 . Production of IFNC in both CD8+ and CD4+ T cells stimulated byDC /PLL3 . 7-pp65 . A- C: CD4+ T cells. D - F: CD8+ T cells. A andD: stim ulated by DC /PLL3. 7-pp65. B and E: stim ulated by DC /PLL3. 7. C and F : stim ulated by DC s alone.
讨论
DC是目前已知机体内功能最强的专职性抗原呈递细胞, 能够显著刺激naive T 细胞, 是机体免疫反应的始动者, 可有效刺激T 淋巴细胞活化[ 1- 4]。

本实验通过分离小鼠的骨髓细胞, 在GM-CSF培养下能分化成树突状细胞, 采用ant-iCD 11c磁珠分离、纯化CD11c阳性的幼稚DC, 每只小鼠可获( 1- 2) @ 106 个DC。

幼稚DC 经CpG-DNA 刺激后, 膜共刺激分子CD86和MHCÒ类抗原表达明显上调, 表明CpG-DNA 诱发的to ll样受体9( tol-llike receptor 9, TLR 9 )信号能够刺激DC成熟[ 4]。

近年来, 慢病毒载体介导的基因转染体系因以下特点而得到广泛应用: ¹可将目的基因高效整合至基因组DNA而稳定表达;º慢病毒可高效感染非分裂细胞及分裂细胞;»不易诱
发宿主免疫反应[ 5, 8]; ¼vsvg基因编码的包膜糖蛋白可使慢病毒颗粒抵抗外部压力, 故可用高速离心浓缩病毒颗粒, 以提高病毒滴度及对靶细胞的感染率。

DC是一种非分裂的抗原呈递细胞, 较难转染。

本实验采用MO I值为50的病毒感染体系, 将CMV pp65基因成功且高效的导入小鼠骨髓细胞来源的DC, 结果显示靶细胞EGFP的表达率达30% - 40% , 具有较
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好的重复性。

CMV 特异性CD 4+ Th和CD 8+ CTL 的活化主要依赖于DC呈递PP65的能力, 只有成熟、活化的DC才能高表达共刺激相关分子, 刺激、活化CMV 特异性CD 4+ Th 和CD 8+ CTL, 从而启动抑制CMV活化的T 细胞免疫反应[ 9]。

本实验证实, 表达pp65并经CpG-DNA 刺激成熟的DC 具有以下生物学效应: ¹能够刺激自身naive T 细胞表达活化抗原CD 69, 表达率较未转染DC 明显升高[ ( 45 ? 4. 6)% vs ( 4 ?
1. 3)% , p < 0. 01]; º能刺激CD 4+ 和CD 8+ T 细胞表达IFNC , 表达率较未成熟DC[ ( 6. 7? 0. 9)% vs ( 1. 3 ? 0. 7)%, p < 0. 01) ] 和转染空载体PLL3. 7的DC 组[ ( 6. 7 ? 0. 9)% vs 1. 5?
0. 5)%, p < 0. 01]显著增加。

因此可见, CMV pp65基因修饰并经CpG-DNA诱导成熟的DC 能够体外刺激自身naive T 细胞活化, 诱导自身CD 4+ 、CD 8+ T 细胞分泌INFC。

这些结果提示表达pp65 基因的成熟DC可选择性地激活CMV 特异性T 细胞。

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