不同生长阶段中国花鲈肠道和环境微生物群落分析

第39卷第2期大连海洋大学学报Vol.39No.2 2024年4月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Apr.2024
DOI:10.16535/ki.dlhyxb.2023-186文章编号:2095-1388(2024)02-0215-10不同生长阶段中国花鲈肠道和环境微生物群落分析
梁祖銮1,赵吉臣1,2,廖敏泽1,孙成波1,3∗
(1.广东海洋大学水产学院,广东湛江524088;2.广东省农业科学院动物科学研究所广东省畜禽育种与营养研究重点实验室,
农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室,广东广州510640;3.广东省水产经济动物病原生物学及流行病学重点实验室,广东湛江524088)
摘要:为探究中国花鲈(Lateolabrax maculatus)不同生长阶段肠道和养殖环境微生物组成,选择3月龄
(小规格组,体质量为79.89gʃ14.97g)㊁6月龄(中规格组,体质量为212.67gʃ30.32g)和9月龄(大
规格组,体质量为427.56gʃ69.56g)3个不同生长阶段的中国花鲈,采集其肠道微生物和环境微生物
(养殖水和池塘底泥)进行16S rDNA基因测序数据分析㊂结果表明:不同月龄的中国花鲈肠道微生物与环
境微生物群落结构有较大差异,而不同生长阶段的环境微生物群落结构则无显著性差异(P>0.05);环境
微生物中双色藻属(Cyanobium_PCC-6307)作为差异物种,表现出与硝酸盐氮呈负相关;肠道微生物分
析显示,门水平上,3月龄和6月龄中国花鲈肠道中厚壁菌门(Firmicutes)丰度低于9月龄中国花鲈,属
水平上,3月龄和6月龄中国花鲈肠道中富集的可促进糖利用的鲸杆菌属(Cetobacterium)丰度高于9月龄
中国花鲈,罗姆布茨菌属(Romboutsia)肠道微生物差异贡献度最高㊂研究表明,不同养殖阶段的环境微
生物群落结构无显著性差异,不同月龄中国花鲈间的肠道微生物群落结构有显著性差异,中国花鲈肠道微
生物群落结构受养殖环境的影响㊂
关键词:中国花鲈;肠道微生物;环境微生物;池塘底泥
中图分类号:S917.1㊀㊀㊀㊀文献标志码:A
㊀㊀中国花鲈(Lateolabrax maculatus)又名花鲈,生性凶猛,为肉食性鱼类,分布于日本北海道㊁俄罗斯滨海边疆区㊁朝鲜到中国雷州半岛以西海域[1]㊂中国花鲈富含蛋白质㊁脂肪和碳水化合物等营养成分,具有极高的经济价值,是中国水产养殖3大鱼类之一,在中国的多个沿海省区均有养殖,其中在广东省的产量位居前列,年生产量占中国该品种总产量的一半以上㊂2021年,中国的该品种花鲈年产量超过19.9万t,在中国经济鱼类的养殖产量中居于顶端位置[1]㊂
动物的生长发育受诸多因子调控(如环境因子㊁营养条件和遗传因素等)[2-3],经过不断地深入研究,人们开始意识到肠道微生物在动物生长发育方面起到重要作用[3]㊂肠道微生物与动物生理状态息息相关,即使是同一物种也可能存在巨大差异,这些微生物根据数量可分为优势菌群和次要菌群㊂优势菌群一般指种群密度大的菌类,如人类肠道中常见的类杆菌㊁双歧杆菌和肠杆菌等㊂优势菌群很大程度上决定了菌群的功能,对动物生理调节起到重要作用[4]㊂有些菌群数量虽少,但也被认为是优势菌群,这是因为其对动物生理调控的功能较为重要㊂次要菌群一般指在动物肠道中数量较少的菌类,这类菌的特点是流动性大且具有潜在致病性[4-5]㊂
肠道微生物对动物生理调控是多方面的㊂如在吸收代谢方面,日常食物中有多种糖类动物并非都可以自行利用,此时寄宿在动物肠道中的菌群开始发挥作用,如厚壁菌门作为人体肠道中的优势菌群之一,该门的大多数菌可以将一些宿主无法吸收的多糖通过发酵转化为丁酸最终被利用;人体肠道内第二大优势类群拟杆菌门能够降解碳水化合物,为宿主提供来自食物10%~15%的能量[6-7]㊂现已确定肠道微生物和宿主健康存在直接关系,并对宿主生长发育具有积极作用[4],水产养殖生产过程中也会使用微生物制剂,或是将某些有益菌拌料进行投喂㊂在此条件下养殖的鱼虾生长往往更快且有更
㊀收稿日期:2023-08-19
㊀基金项目:广东省重点领域研发计划项目(2020B020*******);广东省普通高等学校创新团队项目(2021KCXTD026)㊀作者简介:梁祖銮(1998 ),男,硕士研究生㊂E-mail:2112101019@
㊀通信作者:孙成波(1970 ),男,博士生导师,教授㊂E-mail:suncb@
强的抗病力㊂Ji等[8]通过向中国鲈鱼投喂拌有不同浓度枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的饲料,发现饲料中适量添加枯草芽孢杆菌可有效提升试验
个体的抗病力㊂枯草芽孢杆菌常被用作水产养殖的
微生物制剂,主要作用是改善养殖动物肠道微生物
结构并提高抗病力㊂Taoka等[9]也表明,充足的枯草芽孢杆菌膳食补充可以提高水生动物的抗病能
力和抗氧化能力㊂Barnes等[10]认为,肠道微生物在宿主生命周期中发挥着不可或缺的作用,其丰度
和结构与宿主生命活动密切相关㊂变形杆菌和放线
杆菌是常见的致病菌,与动物肠道炎症㊁免疫紊乱
和其他疾病密切相关,其丰度的增加可能在一定程
度上改变动物肠道微生物结构,进而引发疾病㊂芽
孢杆菌可以分泌淀粉酶和脂肪酶,这可以减少动物
肝脏的代谢压力,从而降低肝炎发生的概率[11]㊂肠道微生物在鱼类生长阶段处在一个动态平衡
的状态,并受到多重因素的影响㊂微生物的定植在
宿主还是幼体时就已开始[12],对斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)[13]和斑马鱼(Danio rerio)[14]的研究表明,鱼类在生长发育过程中肠道菌群是在不断变化的㊂饮食被认为是贯穿始终并对动物肠道微生物有重大影响的因素之一,食性会对动物肠道微生物有显著影响,食性差异越大,动物肠道菌群差异就越大[15],即使食性相同,投喂饲料所含蛋白质的占比不同也会影响动物肠道菌群的丰度[16]㊂还有研究表明,为了适应肠道状态的改变,亚洲鲈在饥饿时肠道中拟杆菌门和β-变形菌门会迅速增加[17]㊂此外,能够影响动物肠道微生物的因素甚至还包括季节变化等[15]㊂
水产养殖中,养殖户开始使用一些有益菌调节
养殖生物的肠道微生物,如厚壁菌门下的枯草芽孢
杆菌,就常被用于拌料投喂凡纳滨对虾(Litope-naeus vannamei)[18]和石斑鱼[Epinephelus fuscogut-tatus(ɬ)ˑnceolatus(ȶ)][19]㊂Tsai等[20]用拌有芽孢杆菌的饲料喂养凡纳滨对虾60d,结果发现,试验组生长显著优于对照组,且肠道总菌数和枯草芽孢杆菌种群密度也高于对照组㊂细菌性肠炎是对虾养殖中经常遇到的问题,其主要原因之一是肠道微生物紊乱㊂此时,对虾肠道内致病菌如发光弧菌和大肠杆菌增加,伴随着有益菌丰度降低,与之相关的免疫㊁营养功能出现异常㊂为此养殖户会使用微生物制剂预防疾病暴发㊂Mahjoub等[21]和Wu等[22]研究表明,额外添加有益菌可以改善养殖动物肠道微生物结构,其作用之一就是通过生态位竞争降低致病菌丰度㊂可见,通过改善肠道微生物可提升宿主的生长㊁免疫和营养等水平㊂
肠道微生物被广泛认为可以有效调节水生动物
的生长,然而关于中国花鲈不同生长阶段的肠道微
生物差异及环境对其肠道微生物的影响尚未见报
道[23]㊂本研究中,分析了中国花鲈不同生长阶段的肠道微生物差异及环境对其肠道微生物的影响,
以期为促进中国花鲈的健康养殖提供基础数据㊂
1㊀材料与方法
1.1㊀材料
试验于2020年9月22日在广东省珠海市斗门
区白蕉镇中国花鲈养殖区进行,试验选取9口传统
养殖土塘(每个塘平均0.667hm2,养殖密度为1万尾/0.0667hm2),根据不同生长阶段将中国花鲈分为小规格组(3月龄)㊁中规格组(6月龄)和大规格组(9月龄),小㊁中㊁大规格组体质量分别为(79.89ʃ14.97)㊁(212.67ʃ30.32)㊁(427.56ʃ69.56)g,每组设3个平行㊂随机从各不同月龄的养殖池塘中分别取中国花鲈50尾,测量其平均体质量㊂
1.2㊀方法
1.2.1㊀肠道和养殖环境样本采集㊀
肠道样本:从每个组取18尾健康的中国花鲈
用于肠道菌群分析,根据Rungrassamee等[24]的方法,在10mL离心管中收集来自每个池塘3尾鱼的肠道内容物,每组分为6份样品㊂根据取样鱼的月龄分别标记为SI组(SI1~SI6)㊁MI组(MI1~ MI6)和BI组(BI1~BI6)(SI㊁MI和BI分别代表3㊁6㊁9月龄中国花鲈肠道样品)㊂
水体样本:使用梅花点取样法(4条对角线和
池塘中心区域)在水面以下50cm的深度采集1L 水样,使用隔膜真空泵(GM-1.0A,Jinteng)通过膜(0.45μm)过滤,收集生物样品,分别标记为SW组㊁MW组和BW组(SW㊁MW和BW分别代表3㊁6㊁9月龄中国花鲈养殖水体样品),每组设置6个重复[25]㊂
底泥样本:用类似的方法采集底泥,在池塘的
不同点用采泥器取样并在无菌研钵中混匀再保存,
分别标记为SS组㊁MS组和BS组(SS㊁MS和BS
分别代表3㊁6㊁9月龄中国花鲈养殖底泥样品),每组设置6个重复㊂所有样品在-80ħ下超低温冰箱中保存,直到送检㊂
1.2.2㊀水质指标测定㊀养殖水体样本用0.45μm
612大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷
玻璃纤维微过滤器(天津市津腾实验设备有限公司)过滤㊂使用上海三新仪器厂生产的SX-610电分析仪检测水温和pH值,使用光学盐度计检测盐度,采用纳氏试剂法㊁锌-镉还原法和重氮-偶氮光度法分别测定氨氮(NH+4-N)㊁亚硝酸盐氮(NO-2-N)和硝酸盐氮(NO-3-N)的含量[26]㊂
1.2.3㊀DNA提取和测序㊀采用CTAB/SDS法提取样品的全基因组DNA,用10g/L琼脂糖凝胶检测脱氧核糖核酸的浓度和纯度㊂使用无菌水将DNA 稀释至1ng/μL,将得到的DNA进行扩增,对得到的PCR产物在20g/L琼脂糖凝胶上进行电泳检测㊂将PCR产物以等密度比例混合,用Qiagen凝胶提取试剂盒(Qiagen,德国)纯化混合PCR产物[27]㊂
使用TruSeq®DNA PCR-Free Sample Prepara-tion Kit进行文库构建,并添加索引代码㊂在Qu-bit@2.0荧光计(Thermo Scientific)和安捷伦生物分析仪2100系统上评估文库质量㊂最后在Illumina NovaSeq平台上对文库进行测序,并产生250bp的配对末端读数[28]㊂
1.2.4㊀数据处理和物种注释㊀首先对原始数据(raw data)进行拼接㊁过滤,得到有效数据(clean data),然后基于有效数据进行OTUs(operational taxonomic units)聚类和物种分类分析㊂根据OTUs 聚类结果,对每个OTU的代表序列做物种注释,得到对应的物种信息和物种丰度分布情况㊂同时,对OTUs进行丰度㊁Alpha多样性和Venn等分析,得到样本内物种丰富度和均匀度信息,以及不同样本或分组间的共有和特有OTUs信息等㊂
1.2.5㊀微生物多样性分析㊀对OTUs进行多序列比对并构建系统发生树,通过PCoA㊁PCA和NMDS 等降维分析,探究不同样本或组别间的群落结构差异㊂为进一步挖掘分组样本间的群落结构差异,选用T-test㊁Simper㊁LefSe等统计分析方法对分组样本的物种组成和群落结构进行差异显著性检验㊂1.2.6㊀环境因子分析与微生物功能预测㊀结合环境因素进行CCA分析及多样性指数与环境因子的相关性分析,得到显著影响组间群落变化的环境因子㊂扩增子的注释结果还与相应的功能数据库相关联,采用Tax4Fun软件对生态样本中的微生物群落进行功能预测分析㊂
2㊀结果与分析
2.1㊀中国花鲈养殖水体的水质指标
从表1可见:随花鲈生长发育阶段的改变,养殖水体pH略呈上升趋势,亚硝酸盐氮和氨氮含量均呈先升高后降低的趋势,硝酸盐氮含量则呈先降低后升高的趋势;3个养殖阶段水体中,仅氨氮含量有显著性差异(P<0.05),其他3个水环境指标均无显著性差异(P>0.05)㊂
表1㊀不同生长阶段中国花鲈养殖水体水质的变化Tab.1㊀Change in water quality in culture of Lateolabrax maculatus at different growth stages
组别
group
pH值
pH value
硝酸盐氮/
(mg㊃L-1)
NO-3-N
亚硝酸盐氮/
(mg㊃L-1)
NO-2-N
氨氮/
(mg㊃L-1)
NH+4-N SW7.60ʃ0.1217.40ʃ0.800.23ʃ0.040.05ʃ0.00c MW7.64ʃ0.02 5.06ʃ2.310.33ʃ0.04 1.52ʃ0.82a BW7.69ʃ0.20 5.85ʃ2.550.32ʃ0.06 1.00ʃ0.64b ㊀注:SW㊁MW㊁BW分别代表3㊁6㊁9月龄中国花鲈养殖水体水样㊂同列中标有不同字母者表示组间有显著性差异(P<0.05),标有相同字母者表示组间无显著性差异(P>0.05),下同㊂Note:SW,MW,and BW represent3,6and9-month-old Lateo-labrax maculatus aquaculture water sample.The means with different letters within the same column are significantly different in the groups at the0.05probability level,and the means with the same letter within the same column are not significant differences,et sequentia.
2.2㊀OTUs聚类、物种注释及微生物群落组成样本16S rDNA测序结果显示,平均每个样品测得83170条tags,经过质控平均得到78552条有效数据,质控有效数据量达53169条,质控有效率达6
3.81%㊂以97%的一致性(identity)将序列聚类成OTUs,共得到8809个OTUs,然后对OTUs序列与Silva132数据库进行物种注释㊂与数据库Silva132比对并进行物种注释,共鉴定出2界84门183纲400目585科1070属634种,并对不同分类层级统计发现,共有8809个OTUs,其中,能够注释到数据库的OTUs数目为7942 (占比90.16%),注释到界水平的比例为90.16%,门水平的比例为78.87%,纲水平的比例为76.81%,目水平的比例为69.81%,科水平的比例为58.10%,属水平的比例为38.24%,种水平的比例为8.34%㊂对各组样本的稀释曲线分析显示,各组样本稀释曲线最终趋于平坦,说明测序更多的数据量,OTU的种类只会少量增加(图1(a))㊂表明这些测序数据结果合理㊂
在门水平上,各组样本微生物的优势物种主要包括厚壁菌门(Firmicutes)㊁变形菌门(Proteobac-teria)和拟杆菌门(Bacteroidota)(图1(b));在属水平上,各组样本微生物的优势物种为罗姆布茨菌属(Romboutsia)㊁普雷沃氏菌属(Prevotella)
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第2期梁祖銮,等:不同生长阶段中国花鲈肠道和环境微生物群落分析
和邻单胞菌属(Plesiomonas ),优势种为类志贺邻单胞菌(Plesiomonas shigelloides )㊁皮氏罗尔斯顿
菌(Ralstonia pickettii )和巴黎链球菌(Streptococ-cus lutetiensis
)㊂
SI㊁MI 和BI 分别代表3㊁6㊁9月龄中国花鲈肠道样品;SW㊁MW 和BW 分别代表3㊁6㊁9月龄中国花鲈养殖水体样品;SS㊁MS 和BS
分别代表3㊁6㊁9月龄中国花鲈养殖底泥样品,下同㊂
Note:SI,MI,and BI represent intestinal samples of 3,6,and 9-month-old Lateolabrax maculatus ,respectively;SW,MW,and BW represent water
samples from 3,6,and 9-month-old Lateolabrax maculatus aquaculture ,respectively;SS,MS,and BS represent sediment samples from 3-month-old,6-month-old,and 9-month-old Lateolabrax maculatus culture,respectively,et sequentia.
图1㊀各组样本稀释曲线及门水平的微生物群落组成
Fig.1㊀Rarefaction curves and microbiota composition of samples in each group at phylum level
2.3㊀微生物多样性分析
2.3.1㊀养殖水体、底泥和中国花鲈肠道微生物群落Alpha 多样性指数㊀养殖水体㊁底泥和中国花鲈肠道微生物群落Alpha 多样性指数见表2,并通过等级聚类曲线进行可视化分析(图2(a ))㊂Alpha 多样性分析显示:3月龄和6月龄中国花鲈肠道微生物的Observed species㊁Shannon㊁Chao 1
和ACE 指数均比9月龄中国花鲈低,但仅3月龄与9月龄的这些指标间有显著性差异(P <0.05);3月龄㊁6月龄和9月龄中国花鲈养殖水体微生物各项指数间无显著性差异(P >0.05);3月龄㊁
6月龄和9月龄中国花鲈的池塘底泥微生物各项指数间也无显著性差异(P >0.05)(表2)㊂每一组的覆盖率均不低于99.0%,表明测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种,所得数据基本能反映样品真实物种组成情况㊂从Venn 图可见:所有样本共有的OTU 为109个,其中,3月龄中国花鲈的池塘底泥微生物特有OTU 45个,养殖水体微生物
特有OTU 696个,中国花鲈肠道微生物特有OTU
212个;6月龄中国花鲈的池塘底泥微生物特有
OTU 87个,养殖水体微生物特有OTU 510个,中国花鲈肠道微生物特有OTU 605个;9月龄中国花鲈的池塘底泥微生物特有OTU 106个,养殖水体
微生物特有OTU 653个,中国花鲈肠道微生物特有
表2㊀不同样品的Alpha 多样性指数
Tab.2㊀Alpha diversity indices of different samples
组别group 观测数目observed species 香浓指数Shannon index 辛普森
指数Simpson
index
Chao 1
指数Chao 1index
ACE 指数ACE index
测序深度指数goods coverage
SI 500b 4.631b 0.737637.673b
654.340b 0.996SS
401b 5.298a 0.886
458.126b
474.126b
0.998SW 1025a
6.360a 0.9091168.318a 1213.560a
0.994MI
961
a
3.238a 0.7601210.492
a
1226.768
a
0.993MS 525
b
4.730
a
0.925
574.268
b
598.820
b
0.997MW 1262a
5.917a 0.9471513.180a 1547.280a
0.991BI 1134a
4.509a 0.7021507.922a 1544.805a
0.990BS
554b
5.450a 0.916
623.786b
644.907b
0.997BW 1275
a
6.414
a
0.9471433.224
a
1482.856
a
0.993
㊀注:SI㊁MI 和BI 分别代表3㊁6㊁9月龄中国花鲈肠道样品;
SW㊁MW 和BW 分别代表3㊁6㊁9月龄中国花鲈养殖水体样品;SS㊁MS 和BS 分别代表3月龄㊁6月龄和9月龄中国花鲈养殖底泥样品,下同㊂
Note:SI,MI,and BI represent intestinal samples of 3,6,and 9-months-old Lateolabrax maculatus ,respectively;SW,MW,and BW
represent water samples from 3,6,and 9-months-old Lateolabrax mac-ulatus culture pond,respectively;SS,MS,and BS represent sediment samples from 3-month-old,6-month-old,and 9-month-old Lateolabrax
maculatus culture,respectively,et sequentia.
OTU 1374个(图2(b))㊂
2.3.2㊀微生物群落特征与环境因子的影响分析㊀对属水平上中国花鲈肠道㊁底泥和水中主要细菌群的物种组成进行分析,所有样本中未在该分类级别上
8
12大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷
注释的物种被合并到 others 中,各组微生物群落属水平组成见图3(a),包括罗姆布茨菌属㊁普雷沃氏菌属㊁邻单胞菌属㊁鲸杆菌属(Cetobacteri-um )㊁双色藻属(Cyanobium _PCC-6307)和梭状芽孢杆菌属(Clostridium _sensu_stricto_1)等㊂
对肠道微生物分析显示,在属水平上,3月龄和6月龄中国花鲈肠道微生物中鲸杆菌属含量较高,
9月龄肠道微梭状芽孢杆菌属含量较高(图3(b)),根据Bray-Curtis 差异指数的分解,量化每个物种对两组之间差异的贡献度,对3月龄㊁6月龄和9月龄肠道微生物差异贡献度最高的是罗姆布茨菌属㊂对水体微生物分析显示,在属水平上,3月龄中国花鲈养殖水体中福格斯氏菌属(Vogesella )含量较高,6月龄和9月龄中国花鲈养殖水体中双色藻属含量较高(图3(c))㊂对底泥微生物分析显示,在属水平上,3月龄中国花鲈的养殖池底泥中普雷沃氏菌属丰度较高(图3(d))㊂结合环境因子分析显示,双色藻属与氨氮和亚硝酸盐氮呈正相关,与硝酸盐氮呈负相关,福格斯氏菌与硝酸盐氮呈正相关;只有3月龄中国花鲈养殖水体微生群落与氨氮和亚硝酸盐氮呈负相关(图
4)㊂
图2㊀Alpha 多样性分析Fig.2㊀Alpha diversity
analysis
图3㊀不同样品微生物群落结构差异分析
Fig.3㊀Analysis of differences in microbial community structure among different samples
9
12第2期梁祖銮,等:不同生长阶段中国花鲈肠道和环境微生物群落分析
图4㊀水体微生物与环境因子的关联分析Fig.4㊀Correlation analysis between microorganisms in water and environmental factors
2.4㊀微生物群落的相似性和差异性PCoA分析显示,水平轴PCoA1对样品的贡献
率为43.22%,而垂直轴PCoA2贡献率为16.12% (图5)㊂不同月龄的底泥微生物样品都聚集在第二象限,3个不同月龄的中国花鲈底泥微生物群落紧密聚类,再结合Adonis分析(表3),表明3个不同生长阶段的中国花鲈底泥微生物群落结构无显著性差异(P>0.05);不同月龄的水体微生物样品均聚集在第一象限,6月龄和9月龄中国花鲈养殖水体微生物群落紧密聚类但二者无显著性差异(P> 0.05),3月龄中国花鲈养殖水体微生物群落倾向于单独聚类且与6月龄和9月龄无显著性差异(P>0.05);3月龄和9月龄中国花鲈肠道微生物距离较远,说明两个组的中国花鲈肠道微生物间有显著性差异(P<0.05),6月龄中国花鲈肠道微生物与3月龄和9月龄中国花鲈均倾向紧密聚集, 6月龄中国花鲈肠道微生物与3月龄和9月龄中国花
图5㊀基于Weighted Unifrac距离的PCoA分析Fig.5㊀PCoA analysis based on Weighted Unifrac distance
表3㊀基于Adonis的组间差异分析
Tab.3㊀Analysis of differences between groups based on A-donis
组别group F检验F model R2(残差residual term)Pr(>F) BS-MS
BS-SS
MS-SS
BW-MW
BW-SW
MW-SW
BI-MI
BI-SI
MI-SI
1.1554
0.8640
1.5240
2.4045
8.8844
5.4347
1.2637
2.5153
1.2637
0.10357(0.89643)
0.07953(0.92047)
0.13224(0.86776)
0.19384(0.80616)
0.47046(0.52954)
0.35211(0.64789)
0.11219(0.88781)
0.20098(0.79902)
0.11219(0.88781)
0.232
0.594
0.099
0.071
0.001
0.002
0.250
0.014
0.250㊀注:R2表示不同分组对样本差异的解释度,即分组方差与总方差的比值,R2越大表示分组对差异的解释度越高;Pr表示P 值,当其小于0.05时说明本次检验的可信度高㊂Note:R2represents the explanatory power of different groups on sam-ple differences,that is,the ratio of group variance to total variance.A larger R2indicates a higher explanatory power of the group on differ-ences;Pr represents the P-value,which is less than0.05,indicating a high reliability in this test.
鲈间无显著性差异(P>0.05)㊂中国花鲈的肠道微生物在第三㊁四象限聚集,养殖水体微生物在第一象限聚集,底泥微生物在第二象限聚集,表明环境微生群落和肠道微生物间存在较大差异㊂
对所有样本组进行LefSe分析,3㊁6㊁9月龄中国花鲈肠道微生物拥有差异微生物群落分别为5㊁4㊁13个;3㊁6㊁9月龄中国花鲈养殖水体微生物拥有差异微生物群落分别为13㊁4㊁3个;6㊁9月龄中国花鲈池塘底泥微生物拥有差异微生物群落分别为5㊁6个,最少的是3月龄中国花鲈池塘底泥,为3个(图6)㊂结合Bray-Curtis的MRPP 分析结果,得出3月龄中国花鲈肠道微生物群落结构与9月龄相比有显著性差异(P<0.05)㊂
2.5㊀微生物功能预测
通过Tax4Fun对16S序列的SILVA注释进行KEGG功能预测,获得样本中KO㊁Pathway等功能的相对丰度㊂
通过Welch s T检验获得丰度平均值显著差异的菌群功能聚类(图7),其中,9月龄中国花鲈肠道微生物的甘氨酸㊁丝氨酸和苏氨酸代谢,染色体和相关蛋白,细胞运动蛋白,乙氧基化物与二羧酸盐代谢,双组分系统等功能丰度高于3月龄中国花鲈肠道微生物,9月龄中国花鲈肠道微生物的淀粉与蔗糖代谢,肽聚糖生物合成和蛋白质降解,氧化磷酸化等功能丰度高于6月龄中国花鲈肠道微生
022大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷
图6㊀基于LefSe 分析的样本间显著差异微生物
Fig.6㊀Significant differences microorganisms between samples based on LefSe analysis
图7㊀基于Tax4Fun 分析的功能注释聚类热图
Fig.7㊀Functional annotation clustering heatmap based on Tax4Fun analysis
物㊂这表明,在新陈代谢和环境信息处理方面9月龄的中国花鲈道菌群具有优势㊂
3㊀讨论
3.1㊀不同生长阶段中国花鲈肠道微生物的差异
肠道微生物受多方面因素影响,包括宿主年龄和环境因子等㊂本研究中从总体上来看,9月龄中
国花鲈肠道微生物无论是观测数量㊁物种多样性和分布均匀程度均比6月龄和3月龄中国花鲈高㊂这与王文娟等[29]的研究结果类似㊂这表明,鱼类从幼苗到成熟的过程中,肠道机能不断完善,肠道微生物种类和数量也不断增加,以满足不同阶段的生理需求,且食性的转变和食物的变化对肠道微生物也有较大影响㊂郁二蒙等[30]关于摄食不同饵料的
大口黑鲈肠道菌群分析的结果也证明了这一观点㊂
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22第2期梁祖銮,等:不同生长阶段中国花鲈肠道和环境微生物群落分析
肠道微生物结构是影响菌群功能的重要因素之一[31]㊂本研究中,3㊁6㊁9月龄3组不同生长阶段的中国花鲈肠道微生物群落结构有显著性差异,在门水平上差异贡献度最大的是厚壁菌门,厚壁菌门的许多细菌已被证实具有转化碳水化合物的能力,有助于宿主对饲料的利用[32]㊂拟杆菌门与厚壁菌门同为肠道主要菌群,二者存在一种互相促进的共生关系,可共同促进宿主吸收或储存能量,故消化道内拟杆菌门与厚壁菌门对发酵多糖十分重要;此外,二者的比例也十分重要,拟杆菌门降低或者厚壁菌门升高均有助于促进增肥[32-33]㊂
本研究表明,在属水平上肠道微生物差异贡献度最大的是罗姆布茨菌,其次是普雷沃氏菌㊂罗姆布茨菌能将宿主难以消化的大分子碳水化合物发酵代谢为丁酸等短链脂肪酸,降低肠道pH,提高宿主的免疫调节能力,维持肠道微生态平衡[34]㊂功能预测结果也表明,9月龄中国花鲈肠道微生物的氨基酸代谢㊁脂肪酸代谢和消化系统功能等类群的丰度较高㊂普雷沃氏菌有助于分解蛋白质和碳水化合物食物,该菌通常被认为是一种与健康的植物性饮食相关的菌,且普雷沃氏菌的减少与某些疾病相关[35]㊂可见,肠道微生物不仅调控宿主的代谢,同时也受到宿主肠道环境变化的影响,如罗姆布茨菌可以促进糖类大分子的吸收,食物中糖类大分子增多也为罗姆布茨菌提供了合适的条件,使其成为优势菌群㊂此外,本研究中还发现,在3月龄和6月龄中国花鲈肠道中鲸杆菌的丰度高于9月龄中国花鲈,这与前人的研究结果不同㊂Wang等[36]研究表明,醋酸杆菌(Acetobacterium balch)会在杂食性和植食性组中富集,而本研究中则是投喂蛋白质含量较高的3月龄和6月龄中国花鲈肠道中富集了更多的醋酸杆菌㊂现已确认,醋酸杆菌属下的索氏鲸杆菌和乙酸均可通过副交感神经系统调控激活胰岛素表达,促进鱼体糖利用能力[37]㊂
本研究3组肠道微生物数据中,9月龄中国花鲈肠道中邻单胞菌属丰度最高㊂类志贺邻单胞菌作为邻单胞菌属唯一的一个种,可对营养吸收造成影响㊂未造成疾病暴发原因可能是数量未超过安全阈值[38],也有可能是9月龄中国花鲈肠道中其他有益菌发挥了作用,具体原因有待研究,这也间接表明9月龄中国花鲈的免疫力优于其他组㊂这与人们通常的认知一致,成熟个体在营养㊁代谢和免疫等方面均优于幼体㊂许多疾病多发生在鱼类幼期,如细菌性肠炎㊁烂鳃和水霉病等㊂这些疾病多是细菌性疾病,当个体发育成熟,各项生理机能逐渐完善,肠道内也建立起了一个结构稳定的微生物群落,病害的发生会显著降低㊂
3.2㊀环境微生物差异形成原因及可能对不同生长
阶段花鲈肠道微生物的影响
环境微生物群落会因水体理化因子而发生改变㊂如本研究中梭状芽孢杆菌㊁普雷沃氏菌㊁罗姆布茨菌均表现出与氨氮㊁亚硝酸盐氮和硝酸盐氮具有相关性,双色藻与氨氮和亚硝酸盐氮呈正相关,与硝酸盐氮呈负相关,水体中双色藻的占比随生长阶段的改变而增加㊂双色藻可以利用水体中的氨氮和亚硝酸盐氮,水生生物养殖过程中氨氮和亚硝酸盐氮的不断累积给双色藻提供了充足的营养条件,使其可以快速生长,当水中双色藻密度变大,被水中生物刻意或无意摄入的可能性也会增加,进而影响生物的肠道微生物,其他菌种也可能通过类似的方法影响生物的肠道微生物㊂但9月龄中国花鲈肠道中的双色藻数量低于3月龄中国花鲈,这可能与早期中国花鲈以小型浮游动物为食有关,小型浮游动物又以双色藻为食,中国花鲈捕食后将双色藻一并带入体内,其具体原因还有待研究㊂结合花鲈养殖水体中氨氮㊁亚硝酸盐氮和硝酸盐氮的变化趋势推断,双色藻对减少水体中氮元素的积累可能有积极作用,进而推动水体氮循环,使普雷沃氏菌㊁罗姆布茨菌等有益菌在水体中丰度增加,促进环境微生物对肠道微生群落的影响㊂
4㊀结论
1)不同月龄的中国花鲈肠道微生物群落结构存在明显差异,罗姆布茨菌和普雷沃氏菌是主要差异微生物,在9月龄中国花鲈肠道中富集最高㊂2)不同养殖阶段水环境微生物群落结构无显著性差异,氨氮㊁硝酸盐氮和亚硝酸盐氮均会影响环境微生物在群落中的占比㊂
3)养殖环境微生物对中国花鲈肠道微生物有一定影响㊂
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222大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第39卷。