微生物技术在废水处理中的应用—基因工程菌降解污染物技术

基因工程(gene engineering)的“四步曲”
1 提取目的基因 2 目的基因与运载体结合 3 将目的基因导入受体细胞 4 目的基因的检测和表达
基因工程(gene engineering)的原理
1
2
基因工程的操作工具
1.基因的剪刀 ——限制性内切酶
2.基因的针线 ——ＤＮＡ连接酶
3.基因的运输工具 ——运载体
恶臭假单胞菌 AC59
质粒
CAM质粒
质粒
铜绿色假单胞菌 PAO
AC63菌株
质粒
质粒XYL
超级细菌
小结
1）基因工程菌处理废水的三种方法中，生物法具有处理 量大，费用少，较少产生二次污染的优点；
2）基因工程菌处理各种废水的研究目前仍处于实验室研 究阶段，没有被广泛于工业生产中，属于新型的高科技处理 手段。
CTTCATG GAAGTAC TTAA
AATTCCCTAA GGGATT
目的基因
AATTCCGTAG GGCATCTTAA
黏性末端
基因操作(gene engineering)的工具
2.分子针线—DNA连接酶 (DNA linking-enzyme)
积极思考
DNA连接酶连接的是两个脱氧核苷酸 (deoxyribonucleotide)分子的什么部位？
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。
2.基因工程构建的方法
1>.多质粒新菌株的构建
转入一个或多个质粒到受体菌构建出具有新降解能力的 菌株。
2>.降解质粒DNA和染色体DNA的体外重组
降解质粒DNA和染色体DNA分子上具有能够编码降解酶及 有助于生物降解的基因，将这些编码降解酶的基因在体外进 行重组，然后转移到受体细胞中，使受体细胞获得新的降解 能力。
3、基因的“针线” ——DNA连接酶
（1）作用对象：两个具有相同粘性末端的DNA片段。 （2）作用位置：脱氧核糖与磷酸之间的缺口（磷酸二酯键）。 （3）作用结果：形成重组DNA。
G AA TT C
G AA TT C
C TT AA G
C TT AA G
用同种限制酶切
割
G AA TT C
G AA TT C
3>.原生质体融合技术
原生质体融合技术就是利用微生物细胞共生或互生作用 的机理，将多个细胞的优点集中到同一个细胞中。
基因工程 的构建
选 择 性 基 因
启动子
克隆PCR 合成etc.
目 的 基 因
复制子
重组质粒
受 体 菌
表达产物
3.基因工程的基本原理
பைடு நூலகம்
基因工程 的
操作工具
基本 原理
基因工程 的
操作步骤
他将两个菌株进行质粒结合，形成具有产生两种酶的细 菌细胞。结果该细胞可获得具有降解两种染料的新菌株。
• 2007年，Safia等从染料污染的土壤中筛选纯化出了一个 混合菌群JW-2，经16S-RNA确定，它包含类芽孢杆菌、黄 微球菌和球菌3中细菌，能快速高效地处理大量纺织染料 废水。 JW-2在36h内使活性紫5R脱色完全，最佳pH值和温 度分别是6.5-8.5和27-35℃，仅需少量底物（如葡萄糖 0.1% g/L和酵母提取物0.05% g/L）就可以完成完全脱色。 实验表明，次菌株可以对9种不同的染料完全降解，并已 在适当的生物反应器中应用。
• 另外，将经基因技术在菌体中表达的金属结合蛋白分离后 固定在某些惰性载体表面同样也能达到重金属离子高富集 容量的目的.
2．同时提高重组菌的富集容量和对特定重金 属离子的选择性
• 通过特异性金属转运系统的表达，基因工程菌对目标重金 属的富集作用就介于特异性蛋白与目标重金属之间才存在 的生物亲和力，具有很高的排他性，与生物吸附法的表面 吸附特性完全不同，这就使有效回收利用废水中重金属离 子，使废水中重金属元素实现再资源化成为可能。
生长在污染环境中的某些细菌细胞内存在抗重金属的基 因。这些基因能促使细胞分泌出相关的化学物质，增强细胞 膜的通透性，将摄取的重金属元素沉积在细胞内或细胞间。
目前，已经发现抗汞、抗隔和抗铅等多种菌株，不过这 些菌株生长繁殖缓慢，直接用于净化重金属污染物效果欠佳。 人们正视图将抗重金属基因转移到繁殖迅速的受体菌中，使 后者成为繁殖率高、金属富集能力强的工程菌，并用于净化 重金属污染的废水等。
基因工程菌在印染、石油 废水处理的应用
教学内容
• 1.基因工程菌在印染废水的应用 • 2.基因工程菌在石油废水的应用
1.基因工程菌在印染废水的应用
染整行业所用的燃料大多是合成染料，加上一些新型助剂， PVA浆料等的加入，使得印染废水具有以下几个特点： • 1>.色度大，有机物含量高，废水粘性大； • 2>.COD和BOD变化大； • 3>.碱性大； • 4>.可生化性较差； • 5>.水温水量变化较大；
基因工程的操作步骤
1.目的基因的提取 2.目的基因与运载体结合 3.目的基因导入受体细胞 4.目的基因的检测与表达
4.基因工程的应用
利用基因工程技术提高微生物净化环境的能力是用 于环境治理的一项关键技术。这一技术发展到今天,正 形成产业化并列为世界领先专业技术领域之一,广泛应 用于食品、医药、化工、农业、环保、能源和国防等许 多部门,并日益显示出其巨大的潜力。
积极思考 如:EcoRI
1、该限制酶只能识别GAATTC的序列，说明了限制酶具 有的特性是 专一性 。
2、 EcoRI限制酶识别了GAATTC的序列后，将会发生什 么样的变化？
EcoRI 剪切目的基因
CTTCATG AATTCCGTAG AATTCCCTAA GAAGTACTTAA GGCATCTTAA GGGATT
基因工程在重金属废水处理的应用
利用基因工程菌代替普通微生物处理重金属是近年来研 究的热点。基因工程技术在重金属废水治理中的作用主要体 现在以下两个方面：
• 提高微生物菌体细胞对重金属离子的富集容量； • 提高菌体对特定重金属离子的选择性；
1>．提高重组菌重金属离子的富集容量
• 若不考虑重组菌对特定重金属离子的选择性而只要提高重 组菌重金属离子的富集容量，则通过在微生物细胞表面表 达高容量金属结合蛋白或金属结合肽的方法就能很好地达 到目的。
2.基因工程菌在石油废水的应用
石油的危害： 石油是一种成分十分复杂的混合物，由上千种有机化合
物组成，其中，一些有毒的化学物质具有致癌、致畸和致突 变的潜在性。其在开采、炼制、运输和使用过程中，不可避 免的会抛洒或泄露于海洋，河流和土壤，由此也造成石油对 土壤、河流和海洋的严重危害。
20世纪70年代，美国生物学家查克拉巴蒂 （Chakrabarty）针对石油，使湖泊、江、海面造成溢油， 水面浮油影响水生物，破坏水或生态的影响，研究开发出这 项技术。
目前，国际上主要有物理化学法、化学法和生物法三类处理 方法。
物化法 化学法
生物法
优点：处理效果 好、速度快；
缺点：费用高， 易造成二次污染 ；
优点：处理量 大，费用少， 较少产生二次 污染
运用生物工程技术把降解菌的基因片段通过转基因 工程转入絮凝菌株，培养出具有絮凝和降解双功能基 因的高效基因工程菌并应用于染料废水的处理。
进一步的工作是继续构建系列基因工程菌，筛选出 絮凝-降解性能好、遗传特性好和成本低的系列双功能 基因工程菌株。
1983年，瑞士科学家Kulla发现有两种假单胞菌，具有降 解印染废水中两种染料的能力。其一为假单胞菌K24，具有 降解1号橙偶氮染料的质粒；其二为假单胞菌K46具有降解2 号橙偶氮染料的质粒。
胰岛素基因 与运载体 DNA连接
3.THREE
胰岛素基因导 入受体(大肠 杆菌)细胞
基因的“剪刀”
基因的“针线” 基因的运载体
基因操作(gene engineering)的工具
基因的“剪刀”
基因的“针线” 基因的“运载工具”
基因操作(gene engineering)的工具
1.基因的剪刀—限制性核酸内切酶
基因工程菌在重金属废水 处理的应用
教学内容
• 1.基因工程的概念 • 2.基因工程的构建 • 3.基因工程菌的基本原理 • 4.基因工程菌在重金属废水处理中的应用
1.基因工程的概念
基因工程（genetic engineering）是在分子水平上进行 的遗传操作，是指将某一生物（供体）的基因片段在体外经 人工与载体相接（重组），构成重组DNA分子，然后转入另 一生物体（受体）细胞中，使外源基因在受体细胞中得到表 达和遗传。又称重组DNA技术。
通常一种菌仅具有氧化少数几种烃的能力，如将他们混 合培养在一起进行原油降解，则由于原油组分复杂，各组分 降解难易程度不同，不同菌种对石油组分的利用性又差别很 大，因此降解过程十分缓慢。为此，考虑将各种菌种所含降 解烃的质粒移入到一个菌株中去。
经研究比较，选择铜绿色假单胞菌PAO（Pseudomonas aeruginosa）作为各种质粒的受体细胞，因为它既能降解 16烷以上的烷烃，又可生活在污水环境中，并且可以转化 接受同属各种的质粒。
(virus) • 目的基因(如人的胰岛素基因)怎样才能导入受体细胞
(如大肠杆菌细胞)？
基因操作(gene engineering)的工具
• 大肠杆菌的质粒 (plasmid)：
运载体 (carrying)应该 具有什么特
点呢?
运载体(carrying) 1能够在宿主细胞内复制并稳定保存； ２具有多个限制酶切点以便与外源基 因相连； ３具有标记基因，便于进行筛选．
C TT AA G
C TT AA
G
基因的针线：DNA连接酶
G AA TT C C TT AA G
基因操作(gene engineering)的工具
3.基因的运输工具——运载体 (carrying)
常用的运载体(carrying)有两类： 1）细菌细胞质的质粒( plasmid) 2）噬菌体(bacteriophages)或某些动植物病毒
培育转基因大肠杆菌的简要过程：
普通大肠杆菌
人体组织细胞
(不能分泌胰岛素)
提
取
与运载体DNA拼接
胰岛素基因
大肠杆菌(含胰岛素基因)
导入
你认为上述培育转 基因大肠杆菌的关
键步骤有哪些？
转基因大肠杆菌 (能分泌胰岛素)
• 培育转基因大肠杆菌的关键步骤：
1.ONE
胰岛素基 因从人体 细胞内提 取出来
2.TWO