细胞冻存液、冻存复苏方法及其应用[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201811072202.1
(22)申请日 2018.09.14
(71)申请人 上海慧存医疗科技有限公司
地址 201203 上海市浦东新区芳春路400号
1幢3层
(72)发明人 鄢和新　杨秋蕊　翟志敏　
(74)专利代理机构 上海恒锐佳知识产权代理事
务所(普通合伙) 31286
代理人 黄海霞
(51)Int.Cl.
A01N 1/02(2006.01)
C12N 5/00(2006.01)
C12N 5/0775(2010.01)
(54)发明名称
细胞冻存液、冻存复苏方法及其应用
(57)摘要
本发明提供一种细胞冻存液，所述细胞冻存
液包含酰基化ε-多聚赖氨酸、多元醇和平衡缓
冲液。

本发明所述细胞冻存液用多元醇和酰基化
ε-多聚赖氨酸溶液替代了有毒性的二甲基亚砜
作为冷冻保护剂，减小了冻存复苏过程中对细胞
的损伤，提高了细胞存活率。

本发明还提供了利
用所述细胞冻存液冻存复苏细胞的方法以及所
述方法在冻存干细胞和免疫细胞中的应用，该方
法操作简单可行，适应细胞治疗的临床大规模使
用，极大地方便了细胞冻存技术在临床上的应
用。

权利要求书2页 说明书17页CN 109221082 A 2019.01.18
C N 109221082
A
1.一种细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液包含酰基化ε-多聚赖氨酸、多元醇和平衡缓冲液。

2.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为10～200mg/mL，所述多元醇的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为1％～20％，余量为所述平衡缓冲液。

3.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述酰基化ε-多聚赖氨酸选自丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸、戊二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸或乙二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述多元醇选自丙二醇或甘油。

5.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液还包含糖类。

6.根据权利要求5所述的细胞冻存液，其特征在于，所述糖类包括葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、海藻糖或棉子糖中的至少一种。

7.根据权利要求5所述细胞冻存液，其特征在于，所述细胞冻存液中，所述糖类含量为2～40mM。

8.根据权利要求2所述的细胞冻存液，其特征在于，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为80～130mg/mL，所述多元醇的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为10％～20％。

9.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述平衡缓冲液包括可溶性钠盐、可溶性钾盐、可溶性镁盐和可溶性钙盐，所述平衡缓冲液中，所述可溶性钠盐含量为10～120mM、所述可溶性钾盐含量为10～120mM、所述可溶性镁盐含量为5～15mM，所述可溶性钙盐含量为0.1～1mM。

10.根据权利要求9所述的细胞冻存液，其特征在于，所述平衡缓冲液还包括渗透压稳定剂、还原剂、氨基酸和活性代谢中间产物，所述平衡缓冲液中，所述渗透压稳定剂含量为0.01～40mM，所述还原剂含量为0.002～5mM，所述氨基酸含量为15～50mM，所述活性代谢中间产物的含量为1～10mM。

11.根据权利要求10所述的细胞冻存液，其特征在于，所述渗透压稳定剂选自甘露糖醇、羟乙基淀粉、羧甲基纤维素钠、右旋糖酐-40或山梨醇中的至少一种；所述还原剂选自维生素C、维生素E、谷胱甘肽、N-乙酰-L-半胱氨酸或叔丁基对苯二酚中的至少一种，所述氨基酸选自组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸中的至少一种，所述活性代谢中间产物选自α-酮戊二酸或腺苷。

12.根据权利要求11所述的细胞冻存液，其特征在于，所述还原剂包含维生素C、N-乙酰-L-半胱氨酸和叔丁基对苯二酚。

13.根据权利要求12所述的细胞冻存液，其特征在于，所述维生素C含量为0.5～2mM，所述N-乙酰-L-半胱氨酸含量为1～5mM，所述叔丁基对苯二酚含量为2～5μM。

14.根据权利要求11所述的细胞冻存液，其特征在于，所述氨基酸为组氨酸和谷氨酸。

15.根据权利要求14所述的细胞冻存液，其特征在于，所述组氨酸含量为20～50mM，所述谷氨酸含量为15～30mM。

16.根据权利要求9或10所述的细胞冻存液，其特征在于，所述平衡缓冲液组分还包括人血清白蛋白，所述平衡缓冲液中，所述人血清白蛋白的质量浓度为2～20mg/mL。

17.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述平衡缓冲液的pH为7.0～7.6。

18.根据权利要求1所述的细胞冻存液，其特征在于，所述平衡缓冲液为基础培养基，所述基础培养基选自MEM培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基或RPMI160培养基中的至少一种。

19.一种细胞冻存复苏方法，其特征在于，包含以下步骤：
S1:取待冻存细胞悬液，离心收集细胞，利用权利要求1～18任一项所述的细胞冻存液对离心收集到的所述细胞进行重悬并调整所述细胞的浓度，获得细胞悬液；
S2:吸取所述细胞悬液分装于冻存管或冻存袋中，然后将所述冻存管或冻存袋冻存；
S3:取出所述冻存管或冻存袋，在30-40℃的条件下对所述冻存管或冻存袋进行解冻处理，得到复苏后的细胞。

20.根据权利要求19所述的细胞冻存复苏方法，其特征在于，在所述步骤S2中，将所述冻存管或冻存袋置于-82℃～-78℃中冻存。

21.根据权利要求20所述的细胞冻存复苏方法，其特征在于，将所述冻存管或冻存袋置于-82℃～-78℃中冻存至少3小时后移入液氮中冻存。

22.根据权利要求19所述的细胞冻存复苏方法，其特征在于，所述细胞悬液的浓度为1×106～100×106个/mL。

23.根据权利要求19所述的细胞冻存复苏方法，其特征在于，在所述步骤S2中，每个所述冻存管中装入0.2～1mL所述细胞悬液。

24.根据权利要求19所述的细胞冻存复苏方法，其特征在于，在所述步骤S2中，每个所述冻存袋中装入10～50mL所述细胞悬液。

25.一种如权利要求19～24任意一项所述的细胞冻存复苏方法在冻存干细胞中的应用。

26.一种如权利要求19～24任意一项所述的细胞冻存复苏方法在冻存免疫细胞中的应用。

细胞冻存液、冻存复苏方法及其应用
技术领域
[0001]本发明涉及临床医学技术领域，具体涉及细胞冻存液、细胞冻存复苏方法及其应用。

背景技术
[0002]细胞治疗在各大疾病领域上发挥重要作用，细胞治疗是利用成体细胞或干细胞对组织或器官进行修复的治疗方法。

其中，干细胞和免疫细胞是疾病治疗的种子细胞。

[0003]干细胞由于具有自我更新和多向分化的潜能，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞，已经被广泛应用于科学研究和临床治疗。

随着细胞替代治疗的发展，干细胞移植治疗已成为临床上治疗某些疾病的重要手段。

目前在世界范围内已经有干细胞药物产品上市，随着科技的发展，干细胞会更有效和广泛的用于各种疾病的治疗，以弥补传统药物治疗对于某些疾病效果不佳的不足。

人们需要将有用细胞种子资源保存起来以供日后的方便使用，以及在需要时用于科学研究和临床治疗。

[0004]免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答相关的细胞，包括淋巴细胞、树突状细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞、肥大细胞等。

随着免疫细胞生物学及免疫分子生物学的高速发展，体细胞免疫治疗已成为肿瘤患者放疗、化疗后辅助治疗的重要手段之一，其对于促进患者免疫系统的重建、消除残留病灶及骨髓净化都具有良好效果。

提前将免疫细胞培养好并冻存起来，待到需要时立刻复苏并回输，则可解决临床治疗过程中时间冲突的问题，并且随时可以使用，对于医生选择治疗方案相当有利。

[0005]目前细胞的低温保存需要添加冷冻保护剂，如果直接冷冻细胞内会产生冰晶对细胞造成伤害从而导致细胞死亡。

冷冻保护剂包括渗透性冷冻保护剂和非渗透性冷冻保护剂，其中，渗透性冷冻保护剂对细胞冻存起到重要的作用，包括二甲基亚砜(DMSO)、甘油、乙二醇、丙二醇、甲醇、乙醇、丙醇、和甲酰胺等。

渗透型冷冻保护剂能够穿过细胞膜渗透到细胞内，其中最常用的就是DMSO，DMSO能够渗透到细胞内增大胞内渗透压，降低冰点，延缓冻存过程。

但是DMSO对细胞存在一定的毒性，在一些临床治疗案例中，注射了含有DMSO的细胞的病人表现出恶心、头痛、高血压和腹部绞痛等症状。

因此，对于临床治疗的细胞应该尽量减少DMSO的用量，或将其替换为一种更安全的冷冻保护剂。

目前已经有一些公司生产出不含DMSO成分的冻存液，例如，日本全药工业株式会社生产的GMP级无血清无DMSO的细胞冻存液，其冷冻保护剂为1，2--丙二醇，虽然毒性较低，但制造商研制过程中从未用它测试过治疗用的细胞类型。

[0006]专利EP2305792A公开的技术使用了不含动物源成分、不含DMSO的细胞冻存液，使用安全无毒的琥珀酰-ε-多聚赖氨酸作为冷冻保护剂替代有毒的DMSO，没有引入任何动物源性物质，减少了污染的几率。

但是其所公开的细胞冻存液在长时间保存细胞时对细胞造成一定程度的损伤，细胞存活率有待进一步提高。

[0007]因此，有必要提供一种新型的细胞冻存液以解决现有技术存在的上述问题。

发明内容
[0008]针对现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种细胞冻存液，实现细胞冻存液的安全无毒、进一步提高细胞存活率。

[0009]本发明的所述细胞冻存液，包含酰基化ε-多聚赖氨酸、多元醇和平衡缓冲液。

[0010]本发明所述细胞冻存液，其有益效果在于：所述细胞冻存液包含酰基化ε-多聚赖氨酸和多元醇，替代了有毒性的DMSO作为冷冻保护剂，稳定性好，无毒副作用，与已有的琥珀酰-ε-多聚赖氨酸冻存液相比，添加所述多元醇，能够进一步减小冻存复苏过程中对细胞的损伤，提高细胞存活率。

[0011]进一步地，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为10～200mg/mL，所述多元醇占所述细胞冻存液体积的百分比为1％～20％，余量为所述平衡缓冲液。

[0012]进一步地，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为80～130mg/mL，所述多元醇的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为10％～20％。

[0013]进一步地，所述酰基化ε-多聚赖氨酸选自丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸、戊二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸或乙二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸中的至少一种。

[0014]进一步地，所述多元醇选自丙二醇或甘油。

[0015]进一步地，所述细胞冻存液组分还包含糖类。

[0016]进一步地，所述糖类包括葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、海藻糖或棉子糖中的至少一种。

[0017]进一步地，所述糖类含量为2～40mM。

[0018]进一步地，所述平衡缓冲液包括：可溶性钠盐、可溶性钾盐、可溶性镁盐和可溶性钙盐，所述平衡缓冲液中，所述可溶性钠盐含量为5～120mM、所述可溶性钾盐含量为5～120mM、所述可溶性镁盐含量为5～15mM，所述可溶性钙盐含量为0.1～1mM。

其有益效果在于：所述平衡缓冲溶液中盐离子浓度模拟细胞内环境，从而减小对细胞的损伤，提高细胞存活率。

[0019]进一步地，所述平衡缓冲液还包含：渗透压稳定剂、还原剂、氨基酸和活性代谢中间产物，所述平衡缓冲液中，所述渗透压稳定剂含量为0.01～40mM，所述还原剂含量为0.002～5mM，所述氨基酸含量为15～50mM，所述活性代谢中间产物含量为1～10mM。

其有益效果在于：所述平衡缓冲液中添加了多种安全的渗透压稳定剂、还原剂、氨基酸和活性代谢中间产物，这些添加物能够稳定细胞膜结构，更好的保存细胞活性，防止细胞衰老。

[0020]进一步地，所述渗透压稳定剂选自甘露糖醇、羟乙基淀粉、羟甲基纤维素钠、右旋糖酐-40或山梨醇中的至少一种。

[0021]进一步地，所述还原剂选自维生素C、维生素E、谷胱甘肽、N-乙酰-L-半胱氨酸或叔丁基对苯二酚中的至少一种。

[0022]进一步地，所述还原剂为维生素C、N-乙酰-L-半胱氨酸和叔丁基对苯二酚。

[0023]进一步地，所述维生素C含量为0.5～2mM，所述N-乙酰-L-半胱氨酸含量为1～5mM，所述叔丁基对苯二酚含量为2～5μM。

[0024]进一步地，所述氨基酸选自组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸中的至少一种。

[0025]进一步地，所述氨基酸为组氨酸和谷氨酸。

[0026]进一步地，所述组氨酸含量为20～50mM，所述谷氨酸含量为15～30mM。

[0027]进一步地，所述活性代谢中间产物选自α-酮戊二酸或腺苷。

[0028]进一步地，所述平衡缓冲液还包括人血清白蛋白，所述平衡缓冲液中，所述人血清白蛋白含量为2～20mg/mL。

[0029]进一步地，所述平衡缓冲液的pH为7.0～7.6。

[0030]进一步地，所述平衡缓冲液为基础培养基，所述基础培养基选自MEM培养基、DMEM 培养基、DMEM/F12培养基或RPMI160培养基中的至少一种。

其有益效果在于：利用所述培养基作为所述平衡缓冲液，操作方便，同时也有利于提高细胞活性。

[0031]本发明还提供了使用所述细胞冻存液进行细胞冻存复苏的方法，包含以下步骤：[0032]S1:取待冻存细胞悬液，离心收集细胞，用所述细胞冻存液重悬细胞并调整细胞浓度，获得细胞悬液；
[0033]S2:吸取所述细胞悬液分装于冻存管或冻存袋中，然后将所述冻存管或冻存袋冻存；
[0034]S3:取出所述冻存管或冻存袋，在30-40℃的条件下对所述冻存管或冻存袋进行解冻处理，得到复苏后的细胞。

[0035]本发明所述细胞冻存复苏方法的有益效果在于：利用本发明所述细胞冻存液冻存复苏细胞，能够有效减少冻存复苏过程中对细胞的损伤，提高细胞存活率。

[0036]进一步地，在所述步骤S2中，将所述冻存管或冻存袋置于-82℃～-78℃中冻存。

其有益效果在于：将所述冻存管直接置于-82℃～-78℃中冻存，该过程不需要程序降温，简化了操作步骤，提高了细胞冻存效率。

[0037]进一步地，将所述冻存管或冻存袋置于-82℃～-78℃中冻存至少3小时后移入液氮中冻存。

其有益效果在于：将所述冻存管先置于-82℃～-78℃中冻存至少3小时，然后再直接移入液氮中长期冻存，该过程简化了操作步骤，相对于细胞的玻璃化冻存，该冻存方法可以有效减少冻存过程中冰晶的形成，减小了对细胞的损伤，提高了细胞存活率。

[0038]进一步地，所述细胞悬液浓度为1×106～100×106个/mL。

[0039]进一步地，在步骤S2中，每个所述冻存管中装入0.2～1mL所述细胞悬液，或者吸取所述细胞悬液分装于冻存袋中，每个所述冻存袋中装入10～50mL所述细胞悬液。

其有益效果在于：本发明所述冻存复苏方法一次性可以冻存细胞数量多，有利于细胞大规模冻存，极大地方便了细胞冻存技术在临床上的应用。

[0040]本发明还提供一种所述细胞冻存复苏方法在冻存干细胞中的应用。

[0041]本发明还提供一种所述细胞冻存复苏方法在冻存免疫细胞细胞中的应用。

具体实施方式
[0042]除非另作定义，本发明权利要求书和说明书中使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属技术领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。

[0043]为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，需要指出的是，以下所述实施例旨在便于对本发明的理解，而对本发明要求保护的范围不起任何限定作用。

基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

下列实施例
中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。

[0044]本发明实施例中的酰基化ε-多聚赖氨酸是两性化合物，偏中性溶液中极易吸水，与水分子形成稳定氢键。

在合适浓度下，由于形成高渗溶液，细胞内水渗出，能够有效避免冷冻时水在细胞内形成冰晶损伤细胞。

同时，酰基化ε-多聚赖氨酸是非渗透性冷冻保护剂，冷冻细胞时，能抑制细胞外的水形成冰晶，从而保护细胞免受损伤。

[0045]本发明实施例中的多元醇属于透入性低温保护剂，这类保护剂属低分子量的中性物质，在溶液中能够强烈地结合水分子，发生水合作用，减弱水的固化过程；另外还可稀释细胞外保存液溶质(电解质)的浓度，因此在冷却时，能透入到细胞内的电解质数量大大减少，而由保护剂替代透入，当细胞外冻结时，可减轻细胞皱缩程度及减缓细胞皱缩的速度。

这类保护剂容易透入或透出细胞，所以在复温解冻时，也可以减低渗透肿胀，从而减轻了冻融对细胞的伤害。

[0046]试剂：
[0047]甘露糖醇为西格玛(Sigma)公司生产，产品编号为：M4125；
[0048]左旋抗坏血酸为西格玛-奥德里奇(Sigma-Aldrich)公司生产，产品编号为：A4544；
[0049]谷胱甘肽为Sigma公司生产，产品编号为：G6013；
[0050]N-乙酰-L-半胱氨酸为Sigma公司生产，产品编号为：A9165；
[0051]叔丁基对苯二酚为Sigma公司生产，产品编号为：112941；
[0052]组氨酸为Sigma公司生产，产品编号为：H6034；
[0053]谷氨酸为Sigma公司生产，产品编号为：G5667；
[0054]α-酮戊二酸为Sigma公司生产，产品编号为：K1128；
[0055]腺苷为Sigma公司生产，产品编号为：A9251；
[0056]25％ε-多聚赖氨酸水溶液为日本的捷恩智(JNC)公司生产；
[0057]丁二酸酐为Aldrich公司生产，产品编号为：239690；
[0058]葡萄糖为Sigma-Aldrich公司生产，产品编号为：V900392；
[0059]甘油为Sigma公司生产，产品编号为：G9012；
[0060]DMSO为Sigma公司生产，产品编号为：34869；
[0061]人血白蛋白静脉输注溶液为瑞士杰特贝林生物制品有限公司生产；
[0062]胎牛血清为以色列的生物科技(Biological Industries，BI)公司生产，产品编号为：04-001-1ACS；
[0063]台盼蓝染色液为碧云天生物公司生产，产品编号为：C0011；
[0064]CD3/CD28为加拿大的干细胞科技(Stem Cell Technologies)公司生产，产品编号为：10971；
[0065]丙二醇为Sigma公司生产，产品编号为：134368；
[0066]IL-2因子为北京同立海源生物公司生产，产品编号为：TL-104；
[0067]针对现有技术存在的问题，提供一种细胞冻存液，所述细胞冻存液包含酰基化ε-多聚赖氨酸、多元醇和平衡缓冲液。

[0068]本发明的一些实施例中，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为10～200mg/mL，所述多元醇的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为1％～20％，余量为所述平衡缓冲液。

所述酰基化ε-多聚赖氨酸选自丁二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸、戊二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸或乙二酸酐酰基化ε-多聚赖氨酸中的至少一种；所述多元醇选自丙二醇或甘油。

[0069]一些具体实施例中，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为10mg/mL、20mg/mL、30mg/mL、40mg/mL、50mg/mL、60mg/mL、70mg/mL、80mg/mL、90mg/mL、100mg/mL、110mg/mL、115mg/mL、120mg/mL、130mg/mL、140mg/mL、160mg/mL、180mg/mL或200mg/mL中的任意一种。

[0070]一些具体实施例中，所述多元醇的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为1％、2％、3％、4％、5％、6％、8％、10％、12％、15％、18％或20％中的任意一种。

[0071]本发明的一些实施例中，所述酰基化ε-多聚赖氨酸的质量浓度为80～130mg/mL，所述多元醇的体积占所述细胞冻存液体积的百分比为10％～20％。

[0072]本发明的一些实施例中，所述细胞冻存液还包含糖类，所述糖类含量为2～40mM，所述糖类包括葡萄糖、半乳糖、乳糖、蔗糖、海藻糖或棉子糖中的至少一种。

[0073]一些具体实施例中，所述糖类的含量为1％、2％、3％、4％、6％、8％、10％、12％、15％、18％或20％中的任意一种。

[0074]本发明的一些实施例中，所述平衡缓冲液包括可溶性钠盐、可溶性钾盐、可溶性镁盐和可溶性钙盐，所述平衡缓冲液中，所述可溶性钠盐含量为10～120mM，所述可溶性钾盐含量为10～120mM，所述可溶性镁盐含量为5～15mM，所述可溶性钙盐含量为0.1～1mM。

[0075]一些具体实施例中，所述可溶性钠盐的含量为10mM、40mM、60mM、80mM、100mM或120mM中的任意一种。

[0076]一些具体实施例中，所述可溶性钾盐的含量为20mM、40mM、60mM、80mM、100mM或120mM中的任意一种。

[0077]一些具体实施例中，所述可溶性镁盐的含量为5mM、6mM、8mM、10mM、12mM或15mM中的任意一种。

[0078]一些具体实施例中，所述可溶性钙盐的含量为0.1mM、0.2mM、0.4mM、0.5mM、0.6mM、0.8mM或1mM中的任意一种。

[0079]本发明的一些实施例中，所述平衡缓冲液还包括渗透压稳定剂、还原剂、氨基酸和活性代谢中间产物，所述平衡缓冲液中，所述渗透压稳定剂含量为0.01～40mM，所述还原剂含量为0.002～5mM，所述氨基酸含量为15～50mM，所述活性代谢中间产物的含量为1～10mM。

所述渗透压稳定剂选自甘露糖醇、羟乙基淀粉、羧甲基纤维素钠、右旋糖酐-40或山梨醇中的至少一种；所述还原剂选自维生素C、维生素E、谷胱甘肽、N-乙酰-L-半胱氨酸或叔丁基对苯二酚中的至少一种；所述氨基酸选自组氨酸、谷氨酸、赖氨酸、色氨酸、苯丙氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨酸、亮氨酸或缬氨酸中的至少一种；所述活性代谢中间产物选自α-酮戊二酸或腺苷。

[0080]一些具体实施例中，所述渗透压稳定剂的含量为0.01mM、0.5mM、1mM、5mM、20mM、25mM、30mM、35mM或40mM中的任意一种。

[0081]一些具体实施例中，所述还原剂的含量为0.002mM、0.005mM、0.01mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.5mM、1.0mM、1.5mM、2.0mM、2.5mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM或5.0mM中的任意一种。

[0082]一些具体实施例中，所述活性代谢中间产物的含量为1mM、2mM、3mM、4mM、5mM、6mM、7mM、8mM、9mM或10mM中的任意一种。

[0083]本发明的一些实施例中，所述还原剂包含维生素C、N-乙酰-L-半胱氨酸和叔丁基对苯二酚。

所述维生素C含量为0.5～2mM，所述N-乙酰-L-半胱氨酸含量为1～5mM，所述叔丁基对苯二酚含量为2～5μM。

[0084]一些具体实施例中，所述维生素C的含量为0.5mM、1.0mM、1.5mM、或2.0mM中的任意一种。

[0085]一些具体实施例中，所述N-乙酰-L-半胱氨酸的含量为1mM、1.5mM、2.0mM、3.0mM、3.5mM、4.0mM、4.5mM或5mM中的任意一种。

[0086]一些具体实施例中，所述叔丁基对苯二酚的含量为2.0μM、2.5μM、3.0μM、3.5μM、4.0μM、4.5μM或5.0μM中的任意一种。

[0087]本发明的一些实施例中，所述氨基酸为组氨酸和谷氨酸。

所述组氨酸含量为20～50mM，所述谷氨酸含量为15～30mM。

[0088]本发明的一些实施例中，所述平衡缓冲液组分还包括人血清白蛋白，所述平衡缓冲液中，所述人血清白蛋白的质量浓度为2～20mg/mL。

[0089]一些具体实施例中，所述人血清白蛋白的质量浓度为2mg/mL、5mg/mL、5mg/mL、8mg/mL、10mg/mL、12mg/mL、14mg/mL、16mg/mL、18mg/mL、18mg/mL或20mg/mL中的任意一种。

[0090]本发明的一些实施例中，所述平衡缓冲液的pH为7.0～7.6。

[0091]本发明的一些实施例中，所述平衡缓冲液为基础培养基，所述基础培养基选自MEM 培养基、DMEM培养基、DMEM/F12培养基或RPMI160培养基中的至少一种。

[0092]本发明实施例提供了利用所述细胞冻存液冻存复苏细胞的方法，包含以下步骤：[0093]S1:取待冻存细胞悬液，离心收集细胞，用所述细胞冻存液对离心收集到的所述细胞进行重悬并调整所述细胞的浓度，获得细胞悬液；
[0094]S2:吸取所述细胞悬液分装于冻存管或冻存袋中，然后将所述冻存管或冻存袋冻存；
[0095]S3:取出所述冻存管或冻存袋，利用水浴的方式解冻，得到复苏后的细胞。

[0096]在所述步骤S1中，所述细胞悬液的浓度为1×106～100×106个/mL。

[0097]一些具体的实施例中，所述细胞浓度为1×106个/mL、2×106个/mL、4×106个/mL、6×106个/mL、8×106个/mL、1×107个/mL、2×107个/mL、5×107个/mL或1×108个/mL中的任意一种。

[0098]在所述步骤S2中，每个所述冻存管中装入0.2～1mL所述细胞悬液或者每个所述冻存袋中装入10～50mL所述细胞悬液。

[0099]一些具体实施例中，每个所述冻存管中装入细胞悬液的体积为0.2mL、0.3mL、0.4mL、0.5mL、0.6mL、0.8mL或1.0mL中的任意一种。

[0100]一些具体实施例中，每个所述冻存袋中装入细胞悬液的体积为10mL、12mL、15mL、20mL、25mL、30mL、35mL、401mL、45mL或50mL中的任意一种。

[0101]在所述步骤S2中，将所述冻存管或冻存袋置于-82℃～-78℃中冻存。

[0102]本发明的一些实施例中，在所述步骤S2中，将所述冻存管置于-82℃～-78℃中冻存至少3小时后移入液氮中冻存。

[0103]本发明实施例提供了所述细胞冻存复苏方法在冻存干细胞中的应用。

[0104]本发明实施例提供了所述细胞冻存复苏方法在冻存免疫细胞中的应用。