辛伐他汀对人牙髓干细胞增殖和分化的影响

辛伐他汀对人牙髓干细胞增殖和分化的影响
目的：研究辛伐他汀对人牙髓干细胞（dental pulp stem cells，DPSCs）增殖和成骨分化的影响。

方法：将第3代人DPSCs在矿化培养液中诱导培养，同时加入不同浓度的辛伐他汀（1×10-5mol/L、1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L），噻唑蓝（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）法检测细胞增殖情况，碱性磷酸酶试剂盒检测碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，茜素红染色鉴定成骨分化。

结果：各浓度辛伐他汀均抑制人DPSCs增值，辛伐他汀浓度为1×10-5mol/L时，抑制作用最明显。

适宜浓度辛伐他汀（1×10-6mol/L、1×10-7mol/L、1×10-8mol/L）促进人DPSCs向成骨细胞分化，其中，1×10-7mol/L 的辛伐他汀促进ALP活性的作用最明显。

结论：辛伐他汀抑制人DPSCs的增值，适宜浓度的辛伐他汀可有效促进人DPSCs的成骨分化。

标签：辛伐他汀；牙髓干细胞；增殖；分化
辛伐他汀是脂类代谢途径中的限速酶3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A （3-hydroxy-3-methylglut aryl coenzyme A reductase，HMG-CoA）还原酶的抑制剂，临床常用于降低胆固醇、降低血脂，减少心脏病的发生[1]。

1999年Mundy 在Science发表文章，报道辛伐他汀在骨代谢方面的影响，其实验研究发现，辛伐他汀可显著增加成骨细胞数量，减少破骨细胞数量，促进松质骨骨量增加，证明辛伐他汀具有良好的促进骨修复的性能[2]。

此后，国内外学者也通过多项实验证实了辛伐他汀的促成骨分化特性。

但以往的研究表明，不同的他汀类药物对不同类型的细胞，其增殖效应是不同的。

他汀类药物可能抑制平滑肌细胞和内皮细胞的增殖，但却可以提高成纤维细胞的有丝分裂活性。

故本实验采用噻唑蓝法、碱性磷酸酶活性检测、茜素红染色等多种方法，研究辛伐他汀对人牙髓干细胞增值及分化的影响。

1 材料和方法
1.1 主要材料：胎牛血清（Hyclone，美国）；DMEM F/12（Gibco，美国）培养基；3mg/ml Ⅰ型胶原酶（Gibco，美国）；0.25% 胰酶（碧云天生物技术研究所，上海）；青链霉素（碧云天生物技术研究所，上海）；PBS缓冲溶液；100μmol/L 抗坏血酸（sigma，美国）；10mmol/L β-甘油磷酸钠（sigma，美国）；2mmol/L L-谷氨酰胺（sigma，美国）；茜素红（Sigma，美国）；碱性磷酸酶试剂盒（南京建成生物工程研究所，南京）；噻唑蓝（Amresco，美国）；辛伐他汀（sigma，美国）；二甲基亚砜（sigma，美国）；Triton X-100（碧云天生物技术研究所，上海）。

1.2 人牙髓干细胞分离培养及传代：选择哈尔滨医科大学附属第二临床医院口腔外科门诊采集的因正畸拔除的正常前磨牙或阻生的正常第三磨牙（患者14～25岁），所有成年患者及未成年患者家屬均知情同意。

依据Gronthos DPSCs 原代细胞培养法[3]，劈开实验牙，用镊子取出牙髓，含双抗PBS充分冲洗，置于体积分数为0.3%的Ⅰ型胶原酶和0.4%的分散酶（1：1）37℃横湿振荡器内消化1h，200目尼龙筛过滤悬液至10ml离心管中，1000rpm离心5min，弃上清，
加入含20%FBS培养基，吹打混匀，血球计数板计数以1×108个/L细胞接种至50ml培养瓶，37℃，5%CO2恒温培养箱中培养。

每周换液两次，细胞融合达80%后，0.25%胰蛋白酶消化，1∶2比例传代。

1.3 DPSCs鉴定：克隆团分选技术将DPSCs悬液进行纯化分离，流式细胞技术鉴定DPSCs，倒置显微镜观察细胞形态，细胞常规传代至第3代用于后续实验[4-5]。

1.4 MTT染色实验：将DPSCs以5×103个/孔接种在九十六孔板中，在37℃、体积分数为5%C02饱和湿度条件下，于矿化培养液中（DMEM F/12培养基、胎牛血清、青链霉素、100μmol/L抗坏血酸，10mmol/Lβ-甘油磷酸钠，2mmol/L L-谷氨酰胺[6-7]），分A、B、C、D、E五组，加入不同浓度辛伐他汀，进行细胞培养。

各组辛伐他汀浓度为A组：1×10-5mol/L；B组：1×10-6mol/L；C组：1×10-7mol/L；D组：1×10-8mol/L；E组：0 mol/L。

于细胞培养第3天加入MTT 20μl，37℃孵育4h，吸去孔内培养基，每孔加入二甲基亚砜150μl，培养板均匀振荡10min，自动酶标仪在490nm波长处测定各孔的吸光度（A）值，观察各组细胞增值情况。

1.5 ALP活性测定：细胞培养条件同MTT实验，细胞培养分为ABCD四组，各组辛伐他汀浓度为：A组：1×10-6mol/L；B组：1×10-7mol/L；C组：1×10-8mol/L；D组：0 mol/L。

培养3天时，去除培养板中培养液，0.01mol/L PBS冲洗细胞3次，加入50μl 0.1% Triton X-100，4℃冰箱过夜，光镜下观察已无明显细胞结构，反复吹打后每个样本加入ALP缓冲液和基质液各50μl，充分混匀，37℃水浴15min，加入显色剂150μl，在酶标仪上选择520nm波长检测各孔A值。

观察各组细胞ALP活性，找出辛伐他汀诱导DPSCs成骨分化的最佳浓度。

1.6 茜素红钙结节染色：将DPSCs以1×105个/孔接种于六孔板中，细胞分组及培养条件同ALP检测实验。

DPSCs于14天进行茜素红染色，培养皿PBS 缓冲液冲洗3遍，95%无水乙醇固定15min，蒸馏水冲洗3次，0.1%茜素红-Tris-HCl （pH=8.3）37℃，30min，蒸馏水轻轻冲洗，干燥。

1.7 统计学分析：使用SPSS 15.0统计学软件，计量资料采用“均值±标准差”形式描述。

对实验组与对照组检测结果进行t检验和方差分析。

2 实验结果
2.1 DPSCs光学显微镜下细胞形态学变化：DPSCs原代培养24h内细胞贴壁缓慢，可见细胞为梭形，形态较小，未完全伸展，且有少量悬浮未贴壁细胞。

48h，细胞梭形，贴壁较多，少量细胞呈克隆团状生长，见图1。

7天后可见DPSCs大量扩增，呈伸展长梭形，克隆团状聚集生长，细胞融合率可达80%。

2.2 辛伐他汀对DPSCs增殖能力的影响：与对照组E组比较，A、B、C、D 四组辛伐他汀对细胞增值均有一定的抑制作用，其中A组、B组、C组与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05），因为A组明显抑制DPSCs的增殖，此浓
度不用于后续实验，见表1。

2.3 辛伐他汀对DPSCs碱性磷酸酶活性的影响：A、B、C组测得的A值明显高于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。

其中，B组对ALP活性的促進作用最显著。

见表2
2.4 辛伐他汀对DPSCs矿化的影响：DPSCs 14天培养后，可见部分细胞发生成骨细胞样多角形以及锥体形态改变。

DPSCs在矿化诱导后逐渐产生白色点状晶体。

经茜素红染色后光学显微镜下均可见橘红色矿化结节，呈团状不规则形态。

如图3。

3 讨论
实验研究表明，DPSCs可向神经细胞、脂肪细胞、肌细胞、成骨细胞等多种细胞分化[8-13]，拥有多向分化的潜能，它可以作为一种组织工程的种子细胞，用于颌骨缺损的修复治疗。

目前，各种药物、细胞因子及可溶性蛋白的添加广泛用于诱导DPSCs的骨向分化，如抗坏血酸、血管内皮生长因子、碱性成纤维细胞生长因子、表皮生长因子等[11-13]。

辛伐他汀作为一种新发现药物，已被证实具有促进成骨的活性。

Wang PS等人的多项统计分析表明，辛伐他汀可以明显提高绝经后妇女和老年人的骨密度，降低骨折发生的比例[14-16]。

Maeda 等研究辛伐他汀对非转化成骨样细胞（MC3T3-E1）和鼠骨髓细胞的影响，发现辛伐他汀能提高成骨细胞ALP活性和促进矿化结节形成[17]。

在骨形成过程中，成骨细胞的演化经历细胞增殖、细胞外基质成熟、矿化和细胞凋亡4个不同阶段，各阶段调控精细，不同标志物特异性表达。

ALP的表达是成骨细胞分化的主要特征之一，是基质成熟的早期标志物，其作用是水解有机磷酸释放出无机磷，促使基质矿化[18-19]。

ALP是骨形成所必需的酶，它的表达表明细胞分化和骨组织形成的开始，代表着骨形成的状况。

矿化能力是干细胞成骨的重要特性之一，组织内的钙质大部分以磷酸钙或碳酸钙的形式存在，茜素红AR-S法通过钙离子与茜素红特异性结合，可使矿化结节呈现鲜红色，因此茜素红染色是鉴定成骨分化的较特异的方法。

本实验采用MTT法、ALP试剂盒、茜素红染色法检测辛伐他汀对人牙髓干细胞的影响。

结果显示，辛伐他汀抑制牙髓干细胞的增值，但对牙髓干细胞向成骨细胞分化具有促进作用。

预示该药具有骨缺损治疗的临床应用前景，为颌骨骨缺损的组织工程修复提供了理论依据。

辛伐他汀对人牙髓干细胞影响的研究还不成熟，本实验只是进行了初步的探讨，具体的药物浓度、作用方式和作用机制还有待进一步研究。

[参考文献]
[1]Istvan ES，Deisenhofer J.Structural mechanism for statin inhibition of HMG-CoA reductase[J].Science，2001，292：1160-1164.
[2]Mundy G，Garrett R，S Harris，et al.Stimulation of bone formation in vitro and in rodents by statins[J]. Science ，1999，286，1946-1949.
[3]Gronthos S，Brahim J，Li W，et al.Stem cell properties of human dental pulp stem cells[J].J Dent Res，2002，81（8）：531-535.
[4]袁梦桐，胡伟平，周海燕，等.体外克隆化传代培养人年轻恒牙牙髓干细胞的研究[J].口腔医学研究，2010，26（5）：624-627.
[5]杨雪超，樊明文.成体人牙髓干细胞的分离与鉴定[J].中华口腔医学杂志，2005，40（3）：244-247.
[6]Laino G，D′Aquino R，Graziano A，et a1.A new population of human adult dental pulp stem cells：a useful source of living autologous fibrous bone tissue（LAB）[J].J Bone Miner Res，2005，20（8）：1394-1402.
[7]Mori G，Centonze M，Brunetti G，et al.Osteogenic properties of human dental pulp stem cells[J]. J Biol Regul Homeost Agents. 2010，24（2）：167-75.
[8]张智慧，胡伟平，郭阳，等.SHH和bFGF体外诱导人牙髓干细胞向神经细胞分化的研究[J].口腔医学研究，2010，26（5）：631-635.
[9]Wzannettino AC，Paton S，Arthur A，et al.Multipotential human adipose-derived stromal stem cells exhibit a perivascular phenotype in vitro and in vivo[J]. J Cell Physiol，2008，214（2）：413-421.[10]Ryusuke Nakatsuka，Tadashige Nozaki，Yasushi Uemura，et al.5-Aza-2′-deoxycytidine treatment induces skeletal myogenic differentiation of mouse dental pulp stem cells[J].Oral biology，2010，55（5）：350-357.
[11]张晓艳，李小彤，曾祥龙.矿化液诱导人前磨牙牙髓干细胞向成骨细胞样细胞的分化[J].上海口腔医学，2010，19（4）：398-402.
[12]D′Alimonte I，Nargi E，Mastrangelo F，et al.Vascular endothelial growth factor enhances in vitro proliferation and osteogenic differentiation of human dental pulp stem cells[J].J Biol Regul Homeost Agents，2011，25（1）：57-69.
[13]KarbanováJ，Soukup T，Suchánek J，et al.Osteogenic differentiation of human dental pulp-derived stem cells under various ex-vivo culture conditions[J].Acta Medica（HradecKrálové），2010，53（2）：79-84.
[14]Wang PS，Solomon DH，Mogun H，et a1.HMG-CoA reductase inhibitors and the risk of hip fractures in elderly patients[J].JAMA，2000，283（24）：3211-3216.
[15]Edwards CJ，Hart DJ，Spector TD.Oral statins and increased bone-mineral
density in postmenopausal women[J].The Lancet，2000，355（9222）：2218-2219.
[16]Wang X，Tokuda H，Hatakeyama D，et al.Mechanism of simvastatin on induction of heat shock protein in osteoblasts[J].Arch Biochem Biophys，2003，415（1）：6-13.
[17]Maeda T，Matsunuma A，Kawane T，et a1.Simvastatin promotes osteoblast differentiation and mineralization in MC3T3-E1 cells [J].Biochem Biophys Res Commun，2001，280（3）：874-877.
[18]Gori F，Thomas T，Hicok KC，et al.Differentiation of human marrow stomal precursor cells：bone morphogenetic protein-2 increases OSF2/CBFA1，enhances osteoblast commitment，and inhibits late adipocyte maturation[J].J Bone Miner Res，1999，14（9）：1522-1535.
[19]Qu Q，Perala -Heape M，Kapanen A，et al.Estrogen enhances differentiation of osteoblasts in mouse bone marrow culture[J].Bone，1998，22（3）：201-209.
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編辑/张惠娟。