霍乱实验室检测

二、标本的增菌和分离培养
• （三）水体标本的增菌 • （四）食品和海（水）产品标本的增菌 • 1、食品标本的增菌：制成3个稀释度标本 分别增菌。首次增菌PH可调至9.2。 • 2、海（水）产品标本的增菌：制成3个稀 释度标本分别增菌。42℃增菌可增加分离 机率。
二、标本的增菌和分离培养
• （五）其他标本的增菌 • 1、物表 • 2、苍蝇：按1：10比例稀释，制成3个稀释 度。
二、标本的增菌和分离培养
• （一）培养基 • 增菌：碱胨水 • 分离：强选择性（TCBS、庆大、4号琼脂） 弱选择性（碱性琼脂、碱性胆盐琼脂） • 培养基进行质量评价
二、标本的增菌和分离培养
• （二）粪便标本的分离培养 • 直接分离培养：急性期、水样便 • 增菌后分离培养：粪便、呕吐物、恢复期 患者和无症状者标本 • 注意事项：增菌时间、二次增菌
二、标本的增菌和分离培养
• （六）增菌液后分离培养 • 从增菌液表层挑取培养物，接种分离平板， 37℃18~24小时。 • 注意事项：1、分离培养基的选择取决于样品中非 目标菌的含量及实验人员的技能水平两方面。 • 2、不同选择性的培养基划线接种的菌量应有区别。 • 3、划线接种确保分出单菌落。 • 4、每个平板仅分离一份样品。 • 5、每份样品都应进行分离培养。
霍乱实验室检测
黄石市疾病预防控制中心
2013年8月
霍乱实验室检测
• • • • 霍乱病例的确诊。 为及时采取防疫措施提供可靠的依据， 对轻型患者和带菌者的发现具有重要意义。 检测依据：《霍乱防治手册》第6版、 WS289-2008《霍乱诊断标准》
霍乱实验室检测
• • • • • • 标本的采集和送检 标本的增菌和分离培养 菌株鉴定 辅助检测 菌株分型 耐药性检测
二、标本的增菌和分离培养
• （七）可疑菌落的挑选 • 圆形、边缘整齐、无色透明或半透明、表 面光滑湿润、扁平或稍隆起如水滴状。 • TCBS：菌落黄色，边缘整齐稍微半透明而 中央不透明的圆形菌落，表面光滑湿润、 扁平或稍隆起。
三、菌株鉴定
• • • • • • • • • • （一）传统方法鉴定 1、血清学鉴定 （1）玻片凝集试验 （2）试管凝集试验 2、形态学和生化鉴定 （1）形态学和动力检查 （2）系统生化试验 （3）氧化酶试验 （4）粘丝试验 （5）与有关细菌鉴别
一、标本的采集和送检
• • • • • • • （一）标本的采集和送检要求： 采样人员经过培训 注意生物安全防护 防止样品污染、交叉污染和自身感染 标本唯一标识 标本送检单填写详细 尽快送实验室
一、标本的采集和送检
• • • • • • • • （二）标本种类及采样方法 患者粪便 患者呕吐物 水体 食品 海（水）产品 物体表面标本 苍蝇标本
实验室生物安全
• • • • • • • 四、意外事件应急处置原则 划伤或刺伤 离心管破裂 皮肤粘膜接触感染性物质 吸入含霍乱弧菌的气溶胶 少量溅洒 五、菌株运输：按UN2814 A类感染性物质 包装运输 • 六、废物处理：蒸汽压力灭菌、化学消毒 法处理
三、菌株定
• （四）霍乱弧菌毒素的检测 • 分离株是否产霍乱毒素有重要的公共卫生 意义。 • PCR法检测霍乱毒素基因。
四、辅助检测方法
• • • • 制动试验 基于胶体金的免疫层析检测 基于上转发光的免疫层析检测 核酸扩增检测
五、菌株分型
• （一）分子分型 • 脉冲场凝胶电泳（PFGE） • （二）O1群埃尔托霍乱弧菌的噬菌体-生物 分型 • 流行株/非流行株 • 根据菌株溶源性、对溶源噬菌体的敏感性、 山梨醇发酵试验、溶血试验分成12个生物 型 • 根据5株分型弧菌噬菌体分成32个噬菌体型
六、耐药性检测
• 纸片扩散法 • 稀释法 • 浓度稀释法
七、实验室检测报告
• • • • 血清群 生物型 血清型 霍乱毒素
实验室生物安全
• • • • • • • • • • • • 一、生物安全管理要求 实验室建设 菌种及样本保存 现场调查和样本采集 二、危害程度分类等级和主要危害 病原体分类等级：流行株二类管理、非流行株三类管理、 BSL-2实验室 感染性物质：粪便、呕吐物、被霍乱弧菌污染的标本、培 养物 主要危害：实验室感染、院内感染、疫情调查和样品采集 三、防护措施 防护要求：BSL-2实验室操作 个人防护装备：工作服、防护手套、口罩（需要时） 彻底消毒清洗
三、菌株鉴定
• （二）分子生物学鉴定 • 实时荧光PCR检测O1/O139群霍乱弧菌rfb 基因 • 外膜蛋白基因ompW • 霍乱毒素基因ctxAB的检测 • 多基因联合检测
三、菌株鉴定
• • • • • • （三）O1群霍乱弧菌的生物型鉴定 第Ⅳ组霍乱噬菌体裂解试验 多粘菌素B敏感试验 鸡红细胞凝集试验 V-P试验 溶血试验