实验二 植物总RNA的提取
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实验二、植物总RNA的提取
一、实验目的： 1.了解真核生物基因组RNA提取的一般原 理。 2.掌握Trizol提取RNA的方法和步骤。 3.了解RNA纯度的检测。
二、一般原理
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍(guā)配制而 成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀 浆和裂解过程中，能破碎细胞、降解蛋白质 和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA 酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、 离心分离后，RNA处于水相中，将水相转 管后用异丙醇沉淀RNA。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙 醇并保存于-70℃
七、检测 1、DNA的紫外分光光度计检测
OD260/OD280>1.8 1OD260=40 μ g/mL DNA
2、甲醛变性琼脂糖电泳检测
八、注意事项
（1）Trizol、DEPC等有毒，与皮肤接触会引起
伤害。操作过程带手套，在通风条件下操作。
５、 10000r/min离心5分钟 ６、取上清液（水相）转入一新的离心管，加 入等体积异丙醇，室温放置3分钟，10000r/min 离心5分钟。 ７、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡 旋混匀，4℃下10000r/min离心5分钟。
８、小心弃去上清液，然后室温或真空干 燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降 低RNA的溶解度。然后将RNA溶于20微升 TE或DEPC处理过的水中，必要时可55℃60℃水溶 10分钟。
五、试剂
1、无RNA酶的无菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积）， 处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温 灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于 低温冰箱。 3、氯仿:异戊醇 [24 : 1 （v/v)] 、氯仿。 4、异丙醇、无水乙醇、70％乙醇。 5、Trizol试剂。
Trizol试剂配制 苯酚饱和液（38%）-380ml/L 硫氰酸胍盐（0.8M-118.16g） 硫氰酸铵（0.4M）-- 76.12g 醋酸钠pH 5（0.1M）- 33.4ml 甘油 – 50ml 加水至1L 。
三、材料 植物组织 四、设备 移液器，冷冻高速离心机，低 温冰箱，台式高速离心机，液氮罐， 陶瓷研钵，1.5ml离心管。
１. 琼脂糖电泳检测
（2）避免带入RNase进入样品
带手套，别用手碰任何与样品接触的物品。 使用新的已灭活RNase的塑料器皿与用具。 （3）爱护仪器设备,安全操作
作业：
1、RNA酶的变性或失活剂有那些？其中在总
RNA的抽提中主要可用哪几种？
有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的 蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提 取中用DEPC,Trizol
六、操作步骤
1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5ml tube
分装0.1克样品；
２. 每管加入0.5ml Trizol液，迅速混匀，注 意样品总体积不能超过所用Trizol体积的 10%。 ３、室温下静置5分钟以利于核酸蛋白质复 合体的解离
４ 、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈 摇荡离心管15秒，室温静置3分钟
2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化？
利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成 一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将Biblioteka mRNA从总RNA中分离出来
补充： ＤＮＡ检测方法 １. 此外分光光度计检测
ＯＤ２６０值＝１时，相当于含５０μg/mL DNA ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１.８～１.９时，DNA较纯 小于１.８时，蛋白含量较高，大于２.０则含有ＲＮ Ａ或有断裂ＤＮＡ
一、实验目的： 1.了解真核生物基因组RNA提取的一般原 理。 2.掌握Trizol提取RNA的方法和步骤。 3.了解RNA纯度的检测。
二、一般原理
Trizol 试剂是由苯酚和硫氰酸胍(guā)配制而 成的单相的快速抽提总RNA的试剂，在匀 浆和裂解过程中，能破碎细胞、降解蛋白质 和其它成分,使蛋白质与核酸分离,失活RNA 酶,同时能保持RNA的完整性。在氯仿抽提、 离心分离后，RNA处于水相中，将水相转 管后用异丙醇沉淀RNA。
RNA可进行mRNA分离，或贮存于70%乙 醇并保存于-70℃
七、检测 1、DNA的紫外分光光度计检测
OD260/OD280>1.8 1OD260=40 μ g/mL DNA
2、甲醛变性琼脂糖电泳检测
八、注意事项
（1）Trizol、DEPC等有毒，与皮肤接触会引起
伤害。操作过程带手套，在通风条件下操作。
５、 10000r/min离心5分钟 ６、取上清液（水相）转入一新的离心管，加 入等体积异丙醇，室温放置3分钟，10000r/min 离心5分钟。 ７、弃去上清液，加入至少1ml的70%乙醇，涡 旋混匀，4℃下10000r/min离心5分钟。
８、小心弃去上清液，然后室温或真空干 燥5-10分钟，注意不要干燥过分，否则会降 低RNA的溶解度。然后将RNA溶于20微升 TE或DEPC处理过的水中，必要时可55℃60℃水溶 10分钟。
五、试剂
1、无RNA酶的无菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积）， 处理过夜后高压灭菌。 2、75%乙醇：用DEPC处理水配制75%乙醇，（用高温 灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于 低温冰箱。 3、氯仿:异戊醇 [24 : 1 （v/v)] 、氯仿。 4、异丙醇、无水乙醇、70％乙醇。 5、Trizol试剂。
Trizol试剂配制 苯酚饱和液（38%）-380ml/L 硫氰酸胍盐（0.8M-118.16g） 硫氰酸铵（0.4M）-- 76.12g 醋酸钠pH 5（0.1M）- 33.4ml 甘油 – 50ml 加水至1L 。
三、材料 植物组织 四、设备 移液器，冷冻高速离心机，低 温冰箱，台式高速离心机，液氮罐， 陶瓷研钵，1.5ml离心管。
１. 琼脂糖电泳检测
（2）避免带入RNase进入样品
带手套，别用手碰任何与样品接触的物品。 使用新的已灭活RNase的塑料器皿与用具。 （3）爱护仪器设备,安全操作
作业：
1、RNA酶的变性或失活剂有那些？其中在总
RNA的抽提中主要可用哪几种？
有DEPC,Trizol，氧钒核糖核苷复合物，RNA酶的 蛋白抑制剂以及SDS，尿素，硅藻土等；在总RNA提 取中用DEPC,Trizol
六、操作步骤
1、取植物嫩叶，液氮研磨，每1.5ml tube
分装0.1克样品；
２. 每管加入0.5ml Trizol液，迅速混匀，注 意样品总体积不能超过所用Trizol体积的 10%。 ３、室温下静置5分钟以利于核酸蛋白质复 合体的解离
４ 、加入0.5ml的氯仿，盖紧离心管，用手剧烈 摇荡离心管15秒，室温静置3分钟
2、怎样从总RNA中进行mRNA的分离和纯化？
利用成熟的mRNA的末端具有polyA尾的特点合成 一段oligo(dT)的引物，根据碱基互补配对原则，可将Biblioteka mRNA从总RNA中分离出来
补充： ＤＮＡ检测方法 １. 此外分光光度计检测
ＯＤ２６０值＝１时，相当于含５０μg/mL DNA ＯＤ２６０／ＯＤ２８０＝１.８～１.９时，DNA较纯 小于１.８时，蛋白含量较高，大于２.０则含有ＲＮ Ａ或有断裂ＤＮＡ