第三章 DNA的复制和损伤与修复

DNA复制的方向 复制的方向
起始点 未复制DNA 未复制 复制叉的推进 起始点 单向复制 起始点
复制叉 起始点 双向复制
复制叉
复制叉
环状 DNA复制时 复制时 所形成的θ结构 所形成的 结构
原核生物DNA复制 三 原核生物 复制
• • • • • • 原核生物DNA聚合酶： DNA聚合酶 （一）原核生物DNA聚合酶： 1958年Kornberg首先从大肠杆菌提取 1958年Kornberg首先从大肠杆菌提取 polⅠ：聚合作用： DNA polⅠ：聚合作用：5` → 3` 5`外切酶活性 外切酶活性： 3` → 5`外切酶活性：校对功能 3`外切酶活性 引物切除、 外切酶活性： 5` → 3`外切酶活性：引物切除、损伤修复 主要功能是切除引物， 主要功能是切除引物，填补冈崎片段产生的 空隙及DNA损伤的修复。 DNA损伤的修复 空隙及DNA损伤的修复。
DNA聚合酶Ⅲ全 聚合酶Ⅲ 聚合酶 酶 θ θ
延长因子
核心酶 ε
β δ γ
DNA聚合酶Ⅲ DNA聚合酶Ⅲ二聚体 聚合酶
α
γ
ι
Pol III′
Pol III
大肠杆菌三种DNA聚合酶比较 大肠杆菌三种 聚合酶比较
比较项目 分子量 每个细胞的分子统计数 5´-3 ´聚合酶作用 ´ 3´-5 ´核酸外切酶作用 ´ 5´-3 ´核酸外切酶作用 ´ 转化率 DNA DNA DNA聚合酶Ⅲ 聚合酶Ⅲ 聚合酶 聚合酶Ⅰ 聚合酶Ⅱ 复合物） 聚合酶Ⅰ 聚合酶Ⅱ （复合物） 109，000 120，000 ， ， 400 + + + 1 100 + + 0 .05 400，000 ， 10-20 + + + 50
第三章
DNA的复制、突变 DNA的复制、 的复制 损伤和修复
第一节 DNA的复制机制 的复制机制 一、半保留复制
• 1958年，Meselson 和Stahl首次用实验 1958年 Stahl首次用实验 证实了DNA的半保留复制。 DNA的半保留复制 证实了DNA的半保留复制。 • 步骤： 步骤： • 用普通培养基（14N）培养15N标记的大肠 用普通培养基（ 杆菌。 CsCl密度梯度离心法分析DNA。 密度梯度离心法分析DNA 杆菌。用CsCl密度梯度离心法分析DNA。 • 加热子一代DNA分子。 加热子一代DNA分子。 DNA分子
切除错配 核苷酸ຫໍສະໝຸດ 聚合酶正 确核 苷酸
复制方向
3´ 5´ 3´ 5´ 3´ 5´
DNA聚合酶的校对功能 聚合酶的校对功能
原核生物DNA聚合反应有关的酶类 原核生物DNA聚合反应有关的酶类
聚合酶(DNA （1）DNA聚合酶 ） 聚合酶 polymetases) （2）引物酶(peimase)和引发体 引物酶(peimase)和引发体 (peimase) 启动RNA RNA引物链的 (primosome) ：启动RNA引物链的 合成。 (3） DNA连接酶 连接酶（ ligase） (3） DNA连接酶（DNA ligase） （4）DNA解链酶(DNA helicase) DNA解链酶(DNA 解链酶 (5）单链结合蛋白(single(5）单链结合蛋白(single(single protein,SSB SSB) strand binding protein,SSB)： 结合在解开的DNA单链上， DNA单链上 结合在解开的DNA单链上，防止重 新形成双螺旋。 新形成双螺旋。 (6） (6）拓扑异构酶 (topoisomerase):兼具内切酶和 (topoisomerase):兼具内切酶和 连接酶活力，能迅速将DNA DNA超螺旋 连接酶活力，能迅速将DNA超螺旋 或双螺旋紧张状态变成松驰状态， 或双螺旋紧张状态变成松驰状态， 便于解链。 便于解链。
二、复制的起始点和方向
• 1.起始点（origin of replication ,ori): 1.起始点（ ,ori): 起始点 • DNA分子上复制开始的固定位点，称为复制的起始点。 DNA分子上复制开始的固定位点 称为复制的起始点。 分子上复制开始的固定位点， 在复制的起始点处有一些特殊的序列。 在复制的起始点处有一些特殊的序列。 • 原核生物DNA分子中只有一个复制起始点，长度200bp 原核生物DNA分子中只有一个复制起始点，长度200bp DNA分子中只有一个复制起始点 左右。大肠杆菌oriC有245bp。真核生物有多个复制起 左右。大肠杆菌oriC有245bp。 oriC 始点。 始点。 • 一般DNA复制起始点都有几段短的必需序列，这些序 一般DNA复制起始点都有几段短的必需序列， DNA复制起始点都有几段短的必需序列 列在DNA复制时与起始复制有关的蛋白质结合。 DNA复制时与起始复制有关的蛋白质结合 列在DNA复制时与起始复制有关的蛋白质结合。在复制 起始点附近还有一段富含AT的序列， AT的序列 起始点附近还有一段富含AT的序列，这段序列能促进 DNA的解链 的解链。 DNA的解链。
• 3.复制的方向：单向或双向 。大多数原核和 3.复制的方向： 复制的方向 真核生物都是双向等速复制方式。 真核生物都是双向等速复制方式。 • 4.复制子的概念: 4.复制子的概念 复制子的概念: • 基因组中能单独进行复制的单位。即每个起 基因组中能单独进行复制的单位。 始点到终止点的区域为一个复制子。 始点到终止点的区域为一个复制子。
成串排列的 三个13bp序列 三个 序列 共有序列 GATCTNTTNTTT
DnaA蛋白结合位点 蛋白结合位点 四个9bp序列 四个 序列
大肠杆菌复制起点成串排列的重复 大肠杆菌复制起点成串排列的重复 序列
共有序列 TTATCCACA
DnaB (解螺旋酶 解螺旋酶) 解螺旋酶
SSB
DnaA
大肠杆菌DNA复制起点在起始阶段的结构模型 复制起点在起始阶段的结构模型 大肠杆菌
• 2.终点（ter）：大肠杆菌的两个复制叉的终止 2.终点（ter）：大肠杆菌的两个复制叉的终止 终点 ）： 一般发生在位于oriC 的相对处的区域， 一般发生在位于oriC 的相对处的区域，称为终 止区。 止区。 • 目前已发现至少6个ter序列。分别称为terE、 目前已发现至少6 ter序列 分别称为terE 序列。 terE、 terD、 terA和terC、 terB、terF， terD、 terA和terC、 terB、terF，它们分别位 于复制叉汇合点两侧约100Kb 100Kb处 terE、 terD、 于复制叉汇合点两侧约100Kb处， terE、 terD、 是一个复制叉特异的终止位点， terC、 terA 是一个复制叉特异的终止位点， terC、 terB、terF是另一个复制叉特异的终止位点 是另一个复制叉特异的终止位点。 terB、terF是另一个复制叉特异的终止位点。6 ter序列都含有 23bp共有序列 序列都含有1 个ter序列都含有1个23bp共有序列 GTGTGGTGT）。Tus（ ）。Tus （GTGTGGTGT）。Tus（terminator utilization substance）蛋白识别和结合于终止位点的23bp substance）蛋白识别和结合于终止位点的23bp 共有序列，具有反解旋酶的活性，能阻止DnaB DnaB蛋 共有序列，具有反解旋酶的活性，能阻止DnaB蛋 白的解旋作用从而抑制复制叉的前进， 白的解旋作用从而抑制复制叉的前进，促使复制 的终止。 的终止。
1、DNA聚合酶 、 聚合酶I-—是一个模板指导酶 聚合酶 是一个模板指导酶
polⅠ是单一肽链的大分子 是单一肽链的大分子, DNA polⅠ是单一肽链的大分子,分子量为 109kD,二级结构以 二级结构以α 螺旋为主。 109kD,二级结构以α-螺旋为主。 用特异的蛋白酶处理，可把DNA polⅠ水解为 用特异的蛋白酶处理，可把DNA polⅠ水解为 两个片段，即在F 螺旋之间发生断裂。 两个片段，即在F，G螺旋之间发生断裂。 小片段：323个氨基酸残基 个氨基酸残基， 3`外切酶 小片段：323个氨基酸残基， 5` → 3`外切酶 活性 大片段或称Klenow片段：604个氨基酸残基 Klenow片段 个氨基酸残基， 大片段或称Klenow片段：604个氨基酸残基， DNA聚合酶活性和3` → 5`外切酶活性。 DNA聚合酶活性和3` 5`外切酶活性。 聚合酶活性和 外切酶活性
DNA聚合酶催化的链延长反应
3´ 5´ 5´ 3´
3´ 3´ ´ 5´ ´
RNA引物 引物
5´
3´ 5´ ´ 3´ ´
5´
模板链
子链
DNA聚合酶的3 DNA聚合酶的3′- 5′ 外切酶水 聚合酶的 解位点
错配碱基 3´ ´ 5´ ´
5´ ´ 3´- 5´核酸外切 ´ ´ 酶水解位点
3´ ´
错配硷基
缺口
连接酶
Mg2+
ATP或NAD＋ 或 PPi或NMN 或
3'
5'
模板链
A G A A C C T T G T C T T G G A A C
5' P P P P P P P P P 3'
原核细胞DNA的半不 连续复制过程
复制叉的 移动方向
5´ ´
3´ ´
解旋酶 解链酶 引物体 SSB
复制的起始
RNA引物 引物
（二）真核细胞DNA复制的特点 真核细胞 复制的特点
• 多个起点复制
起 点 起 点 起 点 起 点 起 点 起 点
telemere） • 端粒（telemere）复制
真核和原核DNA细胞复制比较 细胞复制比较 真核和原核
DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常 DNA复制需要引物，但在线形DNA分子末端不可能通过正常 复制需要引物 DNA 的机制在引物被降解后合成相应的片段. 的机制在引物被降解后合成相应的片段.如果没有特殊的机制 合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。 合成末端序列，染色体就会在细胞传代中变得越来越短。这一 难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA 难题是通过端粒酶的发现才得到了澄清，端粒酶是一种含RNA 的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA 的蛋白复合物，实质上是一种逆转录酶，它能催化互补于RNA 模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持 模板的DNA片段的合成，使复制以后的线形DNA分子的末端保持 DNA片段的合成 DNA 不变。 不变。
• 2、DNA pol Ⅱ：5` → 3`聚合酶活性及3` → Ⅱ： 3`聚合酶活性及 聚合酶活性及3` 5`外切核酸酶活性 外切核酸酶活性。 5`外切核酸酶活性。 • 3.DNA polⅢ: 由10 个亚基组成，分别为α、 polⅢ: 个亚基组成，分别为α δ`、 ε、θ、τ、δ、δ`、β、κ及ψ。是原核 生物体内真正起复制作用的酶。 生物体内真正起复制作用的酶。 亚基： 3`聚合酶活性 α亚基： 5` → 3`聚合酶活性 亚基： 5`外切酶 外切酶, ε亚基：3` → 5`外切酶,校对和编辑 为装配必须。 θ为装配必须。
DNA聚 聚 合酶III 合酶 DNA聚 聚 合酶I 合酶
5´ ´
3´ ´
解旋酶 解链酶 引物酶和 引发体
SSB
RNA引物 引物
3´ ´
5´ RNA ´
引物
3´ ´
5´ ´
连 接 酶 连 接 切 口
3'
5'
模板链
A G A A C C T T G T C T T G G A A C
5' P P P P P OH P P P P 3'
DNA链的合 成与延长
DNA聚合 聚合 酶III DNA聚 聚 合酶I 合酶
3´ ´
DNA链合成 的终止
3´ ´ 5´ ´
前导链
DNA连 连 接酶
3´ ´
随后链 RNA引物 引物
3´ ´
5´ ´
真核生物DNA复制 四、真核生物 复制
（一）真核生物DNA聚合酶： 真核生物DNA聚合酶： DNA聚合酶 真核生物DNA聚合酶有α DNA聚合酶有 五种， 真核生物DNA聚合酶有α、β、γ、δ和ε五种， 都有5`→ 3`聚合功能 聚合功能。 都有5`→ 3`聚合功能。 polα具有引物酶和聚合酶的活性 具有引物酶和聚合酶的活性， polα具有引物酶和聚合酶的活性，通过合成冈崎片 段和起始DNA，参与DNA链合成的引发； 段和起始DNA，参与DNA链合成的引发； DNA DNA链合成的引发 polδ：催化DNA链的延长及填补切除引物后的空隙； DNA链的延长及填补切除引物后的空隙 polδ：催化DNA链的延长及填补切除引物后的空隙； polβ和 具有外切核酸酶活性， polβ和ε ：具有外切核酸酶活性，可能具有修复 和校正作用。 和校正作用。 polγ：存在于线粒体内，参与线粒体DNA复制。 DNA复制 polγ：存在于线粒体内，参与线粒体DNA复制。