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中药材祈州漏芦几种有效成分的高效毛细管电泳法测定
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 中药材祈州漏芦几种有效成分的高效毛细管电泳法测定
 【摘要】目的建立一种高效毛细管区带电泳快速分离和测定祈州漏芦中的有效成分。

方法pH 8.0，30mmol L-1磷酸-硼砂缓冲液;毛细管柱75 m(i.d) 50.2 cm,有效长度40 cm, 压力进样(3.45 kPa)3 s, 25 kV恒压分离;214 nm检测，柱温25℃。

结果6 min内将祈州漏芦样品中的芦丁、槲皮素、甘草苷完全基线分离,线性范围10～500.0 g ml-1。

结论该法具有良好的精密度、回收率及线性关系，可以用来快速定量测定祈州漏芦中3种有效成分的含量。

 【关键词】毛细管电泳; 祈州漏芦; 芦丁; 槲皮素; 甘草苷
 祁州漏芦(Raidx Rhapontici)为菊科植物Rhaponticum uniflorum (L.) DC.的干燥根,始载于《神农本草经》,被列为上品，具有清热解毒、消痈排脓、通乳的功效。

研究表明漏芦提取物对D-半乳糖致衰老小鼠具有抗衰老作用[1];其甾酮总提取物有改善小鼠学习记忆障碍的作用[2]。

 祈州漏芦根中主要成分为鞣质、甾酮类化合物。

对其化学成分的分离测定报道有高效液相法[3，4]和紫外分光光度计法[5],而且测定成分少。

本文首次采用高效毛细管电泳(HPCE)法同时分离祈州漏芦中的芦丁、槲皮素、甘草苷3种化学成分。

现报道如下。

 1 仪器与试药
 毛细管电泳仪，美国Beckman P/ACE MDQ型,二极管阵列检测器;自动控制软件32 Karat Software(Version5.0);Orion 868型pH测试仪，美国Orion公司;Milli-Q SYSTHESIS型超纯水系统，法国Millipore公司;AX-205型0.01 mg/220 g电子分析天平，瑞士梅特勒公司;氢氧化钠(山东单县有机化工厂)、磷酸(山东兖州化工厂)、硼砂(天津市博迪化工有限公司)、乙醇(天津市盛奥化工有限公司)为分析纯;对照品芦丁(批号10270-080128)和甘草苷(批号10162-080301)均购自江西本草天工科技有限公司;槲皮素(批号100081-200406)购于中国药品生物制品检定所。

祈州漏芦产地河北，购于山东鄄城志远中药饮片有限公司(批号081108)，经泰山医学院时元林教授鉴定为祈州漏芦
干燥根。

 2 方法与结果
 2.1 电泳条件以30 mmol L-1的硼砂缓冲液(pH8.0)为介质，未涂层石英毛细管柱(75 m 50.2 cm,有效长度为40 cm，美国Beckman Coulter)为分离通道,柱温25℃;压力进样(3.45 kPa)3 s;25kV恒压分离;214 nm检测;正极进样，负极检测。

 为了使毛细管内表面保持一致，每次实验前，分别用蒸馏水(5 min)、0.1 mol/L NaOH (5 min)、蒸馏水(3 min)、缓冲溶液(10 min)依次冲洗毛细管。

两次运行之间，依次用蒸馏水(2 min)、0.1 mol/L NaOH (3 min)、蒸馏水(2 min)、缓冲溶液(5 min)冲洗毛细管，以提高迁移时间、峰面积和峰高的重现性。

进样前所有溶液需经0.45 m微孔滤膜过滤,并超声脱气。

实验结束后将毛细管用超纯水冲洗10 min储存，备用。

 2.2 对照品溶液的配制分别精密称取芦丁、槲皮素、甘草苷对照品，用50%乙醇溶解分别配制成1 mg/ml对照品储备液，密闭置于4℃下避光保存，实验时用50%乙醇稀释至所需浓度。

 2.3 祈州漏芦药材溶液的制备[5]精密称取祈州漏芦根粗粉约4.0 g,置索氏提取器中，70%乙醇提取3次。

第1次，70%乙醇40 ml，提取1.5 h;第2次，70%乙醇30 ml提取1.0 h;第3次，70%乙醇20 ml提取1.0 h。

合并3次提取液浓缩后5 000 r/min离心5
min，最终定容至10 ml。

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 西归中多糖的提取及含量测定
 【摘要】目的研究西归多糖的提取工艺并测定多糖的含量。

方法通过正交实验确定最佳提取工艺，苯酚-硫酸法测定西归总多糖含量。

结果最佳提取工艺为提取次数3次，固液比1∶10，提取时间1 h，提取温度90℃。

西归总多糖含量为32.71%。

结论该提取工艺合理，测定方法准确。

 【关键词】西归; 多糖; 苯酚-硫酸法
 西归是伞形科属植物西藏凹乳芹Vicatia thibetica de Boiss.的干燥根[1]，主要分布于云南西北部、四川西部及西藏等地。

西归在云南大理有悠久的栽培历史，在大理等地常作为滋补蔬菜炖肉、炖鸡等食用，鲜品也可生吃, 风味独特[2]。

西归含有较多的糖醇和糖[3]。

多糖( polysaccharide) 是构成生命的四大基本物质之一，多糖在增强免疫力、降血糖、抗肿瘤、抗炎、抗病毒、抗衰老、抗凝血等方面发挥着生物活性作用。

因此对多糖的研究与开发已越来越引起人们的广泛关注[4]。

有关西归中多糖的研究尚未见文献报道。

本文对西归中多糖的提取工艺和含量进行了研究，为合理开发、综合利用西归资源提供了切实可行的工艺路线。

 1 仪器与材料
 1.1 仪器SY-21型电热恒温水浴箱(北京泰克仪器有限公司)，TU-1800SPS紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限公司)，FA1004-53423电子天平(上海天平仪器厂)，离心机，真空冷冻干燥机等。

 1.2 药材与试剂
 葡萄糖、乙醇、苯酚、硫酸、氯仿、正丁醇均为AR级。

西归购自云南省大理州鹤庆县马厂乡，经本院生药教研室周浓老师鉴定为西藏凹乳芹Vicatia thibetica de Boiss.的干燥根。

 2 方法与结果
 2.1 多糖的提取及换算因子测定
 2.1.1 西归多糖的提取与精制
 称取西归粗粉50 g，按比例加入蒸馏水，于恒温水浴锅中回流提取，布氏漏斗过滤，将滤液于旋转蒸发仪上进行浓缩，浓缩至约80 ml时，用Savage法除蛋白，即是向浓缩液中加入1 /5 V的氯仿和1 /25 V的正丁醇，强烈振摇30 min，以3 000 r/min离心15 min，除去交界处变性蛋白，水层仍按照此方法反复除蛋白，直至氯仿层与正丁醇层之间无白色沉淀。

然后在上清液中加入一定量无水乙醇，使乙醇的终浓度达一定比例，静置过夜。

沉淀用布氏漏斗抽滤，滤渣以无水乙醇、丙酮、乙醚依次洗涤多次，沉淀放入真空冷冻干燥机内，冷冻干燥48 h，得灰白色粉末状的粗多糖。

 2.1.2 多糖换算因子测定取粗多糖20 mg，精密称定，分别加水溶解并定容至100 ml，精密量取1.0 ml，按标准曲线绘制方法操作，利用标准曲线计算单糖浓度，按公式f=WC D计算换算因子f [W为多糖的重量(mg)，C为溶液中单糖的浓度(mg/ml )，D 为稀释倍数]。

测得西归多糖的f=0.986 3(RSD=1.84%，n =6)。

 2.2 样品多糖的测定取干燥样品粉末1 g，精密称定，至圆底烧瓶中，精密加蒸馏水10 ml，90℃回流提取3次，1 h/次，滤过，滤液定容至100 ml，精密量取续滤液1.0 ml，按标准曲线绘制方法操作，测定其吸光度，按公式计算：多糖含量(%)=C D fW 1 000 100%[C为样品溶液的葡萄糖浓度(mg/ml)，D为样品溶液的稀释倍数，W为样品的重量(g)，f为换算因子]。

 2.3 苯酚试剂的制备取100 g苯酚，加入0.1 g铝片和0.05 g碳酸氢钠，在180～182℃蒸馏，空气冷凝，得白色针状苯酚结晶。

称取5 g此结晶于100 ml量瓶中，用蒸馏水稀释至刻度，摇匀，避光保存，即得浓度为5%的苯酚试剂。

 测定波长的选择：用一定浓度的葡萄糖标准溶液和供试品溶液各1.0 ml置具塞试管中，分别加入5%苯酚溶液1.0 ml摇匀，然后加入浓H2SO4 5.0 ml，摇匀，另以1.0 ml 蒸馏水作为空白液同上操作，沸水浴中恒温15 min，取出，冰水浴冷却至室温，在波长200～800 nm之间扫描。

结果供试品与标准品溶液在487 nm波长处均有最大吸收，故选用487 nm为检测波长。

 2.4 正交实验根据有关资料报道，提取次数(A)，固液比(B)，提取时间(C)，提取温度(D) 4个因素，每个因素3个水平，选用L9(34)正交实验方案提取西归多糖，以多糖含量为指标确定最佳提取工艺。

因素水平见表1，正交实验结果见表2。

表1 西归多糖提取实验因素水平，表2 L9 (34 )正交实验结果(略)。

 由正交实验数据可以得知，各因素对西归总黄酮含量的影响程度不同，其影响大小依次为：D(提取温度) B(固液比) A(提取次数) C(提取时间)。

其最佳提取条件为：A3B1C2D2，即提取次数3次，固液比1∶10，提取时间1 h，提取温度90℃时，提取效果最好。

 2.5 最佳提取工艺验证
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 2.4 标准曲线的绘制由对照品储备液配制成不同质量浓度(10.0，25.0，50.0，100.0，200.0，500 g ml-1)的系列混合液，进行电泳分析。

分别重复3次，以峰面积平均值(Y)对质量浓度(X, g ml-1)进行回归分析，得到芦丁、槲皮素、甘草苷3种成分的线性回归方程分别为：
 Y= 1 514.57+247.21X，r =0.998 8;Y= 3 748.03+731.42X，r =0.998 5;Y= 4 598.26+199.97X，r =0.999 1。

 结果表明3种分析物在10～500.0 g ml-1的浓度范围内呈良好的线性关系;检测限分别为1.86，0.64，1.80 g ml-1。

 2.5 精密度实验精密吸取对照品溶液，重复进样6次，测定峰面积。

当对照品浓度分别为5,50,100 g ml-1时, 芦丁的RSD小于1.86%;槲皮素的RSD小于2.35%;甘草苷的RSD小于2.87。

表明仪器精密度良好。

 2.6 加样回收率实验取已知含量的祈州漏芦药材样品溶液，按高、中、低3个量度准确加入标准品溶液适量，按样品测定法测定，计算回收率。

结果见表1。

表1 加样回收率实验结果(略)
 2.7 实际样品测定结果在相同测定条件下，测定了祈州漏芦中芦丁、槲皮素、甘草苷3种成分的含量。

结果见表2。

标准品电泳图谱见图1，3种分析物的质量浓度均为200 g ml-1;漏芦样品电泳图谱见图2。

通过峰纯度鉴定，3种有效成分的测定均不受其它复杂成分的干扰。

表2 样品测定结果(略)
 3 结论
 本实验在6 min内芦丁、槲皮素、甘草苷3种成分就可以完全基线分离;回收率在
95%～103%之间，RSD小于3% 。

说明采用毛细管电泳法分离测定祈州漏芦中的有效成分，快速准确有效，可以为祈州漏芦的质量控制提供理论依据。

 【参考文献】
 [1]朴龙,张学武,金香子.漏芦提取物抗衰老作用的研究[J].时珍国医国药，2006，17(10)：1918.
 [2]先宇飞，纪雪飞，刘新霞,等，漏芦甾酮总提取物改善小鼠记忆障碍的实验研究[J].中药新药与临床药理，2005，16(6)：405.
 [3]侯柏玲,孟大利,李宁,等,中药漏芦提取工艺的优化[J].沈阳药科大学学报,2007,24 (6):371.
 [4]余孝东, 梁卫文,杨淑华,等,HPLC法测定漏芦药材中卜蜕皮留酮的含量[J].中药材，2002，25(5)：331.
 [5]陈明玉.均匀设计法优选漏芦中芦丁和槲皮素提取工艺[J].时珍国医国药，2006，17(7)：1248.
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