生物化学实验：维生素C定量测定(2,6-二氯酚靛酚滴定法)

ʺ注意事项
【某些水果、蔬菜（如橘子、西红柿等）浆状物泡沫太多，可 加数滴丁醇或醇
【整个操作过程要迅速，防止还原型抗坏血酸被氧化。滴定过 程一般不超过2min。滴定所用的染料不应小于1ml或多于4ml， 如果样品含维生素C太高或太低时，可酌情增减样液用量或改 变提取液稀释度
【 Fe2＋可还原二氯酚靛酚。对含有大量Fe2＋的样品可用8% 乙酸溶液代替草酸溶液提取，此时Fe2＋不会很快与染料起作用
•棉花过滤，滤液避光下保存备用。
注意：维生素C在光下容易分解
二、 标准抗坏血酸液的滴定V1
【取标准抗坏血酸溶液1ml（0.1mg)置100ml锥形瓶中，加9ml 1%草酸
【 用微量滴定管以0.01% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并 保持15s不褪色即达终点，得到V1。
三、1%草酸的滴定V2
ʺ操作方法
一、提取 •水洗干净整株新鲜蔬菜或整个新鲜水果，用纱布或吸水纸
吸干表面水分
•称取5g蔬菜或水果，剪碎,加入少量(1-3ml) 2%草酸，用研 钵研磨至浆状，倒入至100ml的容量瓶中，往研钵中加入少 量多次2%草酸，把研磨后的样品完全转移，并定容至100ml 容量瓶中（研磨，转移，定容）。
【 2%草酸有抑制抗坏血酸氧化酶的作用，而1% 草酸无此作用。
【若提取液中色素很多时，滴定不易看出颜色变化，可用白 陶土脱色，或加1ml氯仿，到达终点时，氯仿层呈现淡红 色
维生素C定量测定（2,6-二氯酚靛酚滴定法）
ʺ目的要求
学习并掌握定量测定维生素C的原理和方法
ʺ实验原理
还原性Vc + 氧化性染料
氧化性Vc + 还原性染料
粉红色 (中性和碱性)
无色
•Vc放在滴定瓶中 •2,6-二氯酚靛酚放在微量滴定管中 •终点前, 2,6-二氯酚靛酚全部被还原为无色
•终点时, 剩下有2,6-二氯酚靛酚.呈现粉红色
•0.01% 2,6-二氯酚靛酚溶液: 50mg 2,6-二氯酚靛酚钠溶于 150ml热水中，冷却后加水稀释至500ml，贮于棕色瓶中 冷藏（4℃）约可保存一周。每次临用时，以标准抗坏血 酸溶液标定。
二、材料 卷心菜等
三、器材 锥形瓶（100ml），组织捣碎器，吸量管（10ml），漏斗，
滤纸，微量滴定管（5ml），容量瓶（100ml，250ml）。
【提取的浆状物如不易过滤，亦可离心，留取上清 液进行滴定。
【样品中可能有其它杂质还原二氯酚靛酚，但反应速度均较抗坏 血酸慢，因而滴定开始时，染料要迅速加入，而后尽可能一点 一点地加入，并要不断地摇动三角瓶直至呈粉红色，于15s内 不消退为终点。
【本实验必须在酸性条件下进行。在此条件下，干扰物反应 进行得很慢
【取10ml 1%草酸作空白对照 【用微量滴定管以0.01% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并 保持15s不褪色即达终点，得到V2
V1 - V2相当于0.1mg抗坏血酸
四、 样品抗坏血酸液的滴定V3
【取滤液10ml(相当于样品Vc的1/10)置100ml锥形瓶中
【 用微量滴定管以0.01% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并 保持15s不褪色即达终点，得到V3。
ʺ试剂和器材
一、试剂
•2%草酸溶液: 草酸2g溶于100ml蒸馏水中。 •1%草酸溶液: 草酸1g溶于100ml蒸馏水中。 •标准抗坏血酸溶液（0.1mg/ml）: 准确称取50mg纯抗坏血
酸（应为洁白色，如变为黄色则不能用）溶于1%草酸溶 液中，并稀释至100ml，贮于棕色瓶中，冷藏。最好临用 前配制。
五、2%草酸的滴定V4
【取10ml 2%草酸作空白对照 【用微量滴定管以0.01% 2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至淡红色，并 保持15s不褪色即达终点，得到V4
V3 – V4相当于X mg抗坏血酸
ʺ计算
锥形瓶中10ml滤液中维生素C含量 ＝ V3 – V4 /V1 – V2 X 0.1 (mg)
5g蔬菜或水果的维生素C含量（样品） ＝ V3 – V4 /V1 – V2 X 0.1 X 10 (mg)