克拉霉素干混悬剂有关物质方法研究

克拉霉素干混悬剂有关物质方法研究
熊雯;罗嫄;熊玲;张静
【摘要】目的建立RP-HPLC法,测定克拉霉素干混悬剂的有关物质.方法采用Agilent 1260 Infinity LC液相色谱仪,色普柱为YMC C18(250mmx4.6mm,5μm)柱,以0.033mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(55∶45)(用85％磷酸溶液或2mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.4)为流动相,检测波长205nm,柱温50℃.结果克拉霉素与9个己知杂质及其他未知杂质均能达到有效分离,克拉霉素及杂质E的线性范围分别为2～1000μg/mL(r=1.000)、0.9～6.75μg/mL(r=0.998);供试品溶液在室温25℃下的12h基本稳定.结论本方法灵敏,准确,专属性强,重现性好,可用于克拉霉素干混悬剂有关物质的测定.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2018(043)007
【总页数】4页(P866-869)
【关键词】高效液相色谱法;克拉霉素干混悬剂;有关物质;杂质检测
【作者】熊雯;罗嫄;熊玲;张静
【作者单位】成都市食品药品检验研究院,成都610045;成都市食品药品检验研究院,成都610045;成都市食品药品检验研究院,成都610045;成都市食品药品检验研究院,成都610045
【正文语种】中文
【中图分类】R978.1
克拉霉素又名甲红霉素，为十四元环大环内酯类抗生素，属于第二代红霉素，其抗菌谱广，抗菌活性高，在国内外受到广泛重视[1]。

克拉霉素干混悬剂具有易于保存，不易变质，容易掌握剂量，可以儿童用药等优点，越来越受消费者青睐。

目前中国药典2015年版收载了克拉霉素原料，片剂和胶囊剂，尚未收载克拉霉素干混悬剂[2-3]。

国内只有3家国内企业生产的产品，雅柏药业的泰必捷，规格
(0.125g)，国药准字H20020365；杭州中美华东制药有限公司的卡迈，规格(0.125g和0.25g)，国药准字：H20000450；还有唯美乐的克拉霉素干混悬剂，规格(0.125g)。

相应标准中均未对有关物质进行质量控制。

英国药典(BP)2017仅收载了原料药[4]，美国药典(USP)40虽收载了克拉霉素干混悬剂，但未对其有关物质进行控制[5]。

为有效控制产品质量，对生产，运输及储藏过程中可能产生的有关物质进行控制，笔者参考相关文献[6-12]，采用碱性缓冲溶液去除辅料干扰等前处理方法，建立了HPLC法对某进口的克拉霉素干混悬剂原研药的有关物质进行研究。

1 仪器与试药
1.1 仪器
Agilent 1260 Infinity LC液相色谱仪(美国Agilent公司)，Satorius BP211D电子天平(德国Satorius公司)。

1.2 试药
克拉霉素干混悬剂(批号：1034320、1036328、1038028、1037987、1041830和1048831，由国外某公司生产)。

规格为125mg/5mL，有60mL/瓶和100mL/瓶两种包装规格。

克拉霉素对照品，克拉霉素混合杂质对照品及克拉霉素各杂质对照品(杂质E、D和H)均为BP对照品，山梨酸钾为LGC实验室标准制剂。

甲醇，乙腈均为色谱纯，美国Fisher公司，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱为YMC C18(250mm×4.6mm,5μm)；流动相为0.033mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈(55:45)(用85%磷酸溶液或2mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.4)；流速：1.0mL/min；柱温：50℃；检测波长：205nm；进样量：50μL。

2.2 溶液的制备
2.2.1 系统适应性溶液
精密称取克拉霉素对照品适量，用乙腈-水(4:6)制成浓度为2.5mg/mL的溶液，作为溶液(1)；取6,11-二-O-甲基红霉素A对照品(杂质E)适量，精密称定，用乙腈-水(4:6)制成浓度为0.45mg/mL的溶液，作为溶液(2)；取山梨酸钾适量，用水溶解并稀释制成浓度为8μg/mL的溶液，作为溶液(3)；取溶液(1)10mL置50mL量瓶中，加0.1mol/L盐酸溶液1mL，混匀，静置15min后，分别加入
0.033mol/L磷酸磷酸二氢钾溶液20mL、溶液(2)5mL和溶液(3)4mL，用乙腈稀释至刻度，摇匀，作为系统适用性溶液。

2.2.2 EP系统适应性混合对照品溶液
取EP克拉霉素鉴别用混合杂质对照品适量，加乙腈-水(4:6)制成浓度为
0.5mg/mL的溶液，作为混合杂质对照溶液。

2.2.3 供试品溶液及对照溶液的制备
称取克拉霉素混悬剂细粉适量(含克拉霉素250mg)，置于50mL具塞离心管中，加10mL 0.067mol/L磷酸氢二钾溶液和10mL水，振摇10min，3000r/min离心10min，弃去上层液，重复操作3次。

用70mL乙腈将残渣转移至100mL容量瓶中，振摇30min，用乙腈稀释至刻度，摇匀，静置5min。

精密量取10mL 置于50mL量瓶中，用乙腈-水(1:2)稀释至刻度，摇匀，滤过，即得供试品溶液；精密量取供试品溶液1mL，置于100mL量瓶中，加乙腈-水(4:6)稀释至刻度，摇
匀，即得对照溶液(1)；精密量取对照溶液(1)1mL，置于10mL量瓶中，加乙腈-水(4:6)稀释至刻度，摇匀，作为对照溶液(2)。

2.3 系统适应性试验
取“2.2.1”项下溶液(1)，“2.2”项下系统适用性溶液，混合杂质对照溶液及供试品溶液各50mL，注入色谱仪，记录色谱图，详见图1～3。

克拉霉素峰的保留时间约为10min，杂质I峰与山梨酸钾峰的分离度应不小于1.0。

通过混合杂质对照品溶液色谱图确定杂质峰位置。

杂质I/杂质A相对于克拉霉素的保留时间约为0.43，杂质D约为0.86，杂质E约为1.55，杂质H约为4.20。

将供试品溶液中的克拉霉素主峰与对照品溶液(1)中的克拉霉素主峰的峰面积相比较，按外标法计算预处理回收率，回收率不得低于75%。

2.4 有关物质测定
取供试品溶液，对照溶液(1)和对照溶液(2)各50mL，注入色谱仪，记录色谱图至克拉霉素峰保留时间的5倍。

供试品溶液色谱图中杂质I/杂质A的峰面积不得大于对照溶液(1)的主峰面积(1.0%)；杂质D，E的峰面积不得大于对照溶液(1)主峰面积(1.0%)；其他单个杂质峰面积不得大于对照溶液(1)的主峰面积(1.0%)；峰面积大于对照溶液(2)的主峰面积0.4倍(0.4%)的次峰不得多于4个；所有次峰面积总和不得大于对照溶液(1)主峰面积的3.5倍(3.5%)。

忽略任何峰面积小于对照溶液(2)色谱图主峰面积(0.1%)的色谱峰，杂质A/杂质I前以及杂质H后洗脱的色谱峰。

图1 EP混合杂质系统色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of EP system suitability solution1：杂质I/杂质A；2：杂质B；3：杂质C；4：杂质D；5：克拉霉素霉素主峰；6：杂质E；7：杂质F；8：杂质P;9：杂质G；10：杂质H 图2 系统适用性色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of system suitability solution1：山梨酸钾；2：杂质I；3：克拉霉素霉素主峰；4：杂质E
图3 供试品溶液有关物质色谱图Fig.3 HPLC chromatogram of sample solution
2.5 专属性试验
取本品适量(约相当于克拉霉素250mg)，平行制备6份，进行破坏性试验。

高温
破坏：样品经100℃高温加热约4h；光照破坏：样品在照度为(4500±500)Lx下
放置10d；氧化破坏：样品通过10mL 0.067mol/L磷酸氢二钾溶液和10mL洗涤3次后，残渣加30%双氧水1mL，放置1h；酸破坏：样品经碱性磷酸盐洗涤3次后，加1mol/L的盐酸5mL，放置4h后，用1mol/L的氢氧化钠中和至中性；碱破坏：样品样品经碱性磷酸盐洗涤3次后，加1mol/L的加NaOH溶液5mL，放置4h，加1mol/L的HCl溶液至中性。

上述经破坏的样品照“2.2.3”项下供试品溶液配制方法操作，按照“2.1”项下色谱条件进行测定。

本品经酸破坏后杂质I
明显增加；经碱破坏和高温破坏，主峰面积有所下降，杂质个数和峰面积均有所增加；经光照、高温破坏和氧化破坏后杂质增加不明显。

说明本品对酸、碱和高温不稳定。

相邻杂质与主成分色谱峰分离较好，说明所建方法的专属性强。

2.6 线性关系
分别精密称取克拉霉素及杂质E对照品适量，用乙腈-水(4:6)制成含克拉霉素2、10、50、100、200、500、1000μg/mL的溶液，以及含杂质E 0.9、1.8、3.25、5.0、6.75μg/mL的溶液，分别精密吸取50mL注入液相色谱仪，记录色谱图。

以峰面积Y对克拉霉素或杂质E(μg/mL)X进行线性回归，得回归方程分别为：克拉霉素：Y=4428.2X-3.668(r=1.000)，杂质E：Y=5.1753X-2.2357(r=0.998)，表
明克拉霉素浓度与色谱峰面积在2～1000μg/mL范围内，杂质E浓度与色谱峰面积在0.9～6.75μg/m L范围内线性关系良好。

2.7 相对保留时间与校正因子
对流动相比例进行了筛选，当流动相为0.033mol/L磷酸二氢钾溶液-乙腈
(55:45)(用85%磷酸溶液或2mol/L氢氧化钾溶液调节pH值至5.4)时，克拉霉素峰与相邻杂质峰，以及各已知杂质峰之间分离良好，结果见表2。

同时对克拉霉素及其杂质D，杂质E，杂质H 3种杂质在2根不同的色谱柱试验，根据进样浓度(μg/mL)对测得的峰面积比值计算各成分的相对校正因子。

2根色谱柱测得的相对校正因子基本一致，相对于克拉霉素，杂质D的校正因子为0.45，杂质E为0.75，杂质H为0.13。

2.8 检测限与定量限
取“2.2.1”项下溶液(1)和溶液(2)逐级稀释，按“2.1”项下色谱条件测定，以信
噪比S/N=3和S/N=10计，测得克拉霉素及杂质E的检测限和定量限分别为10
和35ng，以及15和45ng。

2.9 稳定性试验
取“2.2.3”项下供试品溶液(批号：1034320)，室温下放置，分别在第0、2、4、8和12h精密量取50mL注入液相色谱仪，记录色谱图。

杂质A/I、杂质D、杂质E、其他单个杂质和其他杂质和的RSD均小于2%，表明供试品溶液在12h内稳定，可满足本品测定的要求。

表2 有关物质相对保留时间Tab.2 Relative retention time of related substancest/min 克拉霉素 A/I B C D E F P G H保留时间 10.46 4.46 7.96 8.55 8.98 16.26 17.53 18.60 35.87 43.93相对保留时间 1 0.43 0.76 0.82 0.86 1.55
1.68 1.78 3.43 4.20
2.10 有关物质测定结果
根据有关物质测定方法，对2个规格共6批样品进行了测定，结果见表3。

表3 有关物质检查结果Tab.3 Relevant material inspection results批号1034320 1036328 1038028 1037987 1041830 1048831杂质A/I 0.4% 0.4% 0.4% 0.2% 0.3% 0.2%杂质D 0.1% 0.04% 0.1% 0.04% 0.1% 0.1%杂质E 0.1%
0% 0.2% 0.3% 0.2% 0.2%其他单个杂质 0.7% 0.8% 0.4% 0.7% 0.4% 0.3%其他
杂质和 2.0% 2.0% 2.4% 3.0% 2.3% 2.0%
3 讨论
3.1 杂质归属及定位
克拉霉素是由红霉素A经过结构修饰而获得的。

共有9个已知杂质，其中杂质A
为合成中间体，杂质E、F、P、G和H属于合成副产物，杂质I和D为潜在降解
产物。

杂质I(去克拉定糖基-6-O-甲基红霉素A，也称为Declad)是克拉霉素的主
要酸降解产物。

当前HPLC方法下，杂质A与杂质I的色谱保留时间接近，故将
两种化合物一起报告为Declad。

杂质D(N-去甲基-6-O-甲基红霉素A)可能是克
拉霉素脱甲基化产物。

由于《中国药典》2015版未收载克拉霉素干混悬剂，且原料药未对特殊杂质进行控制。

同时国外进口杂质对照品也仅购得克拉霉素杂质D，杂质E，杂质H，可以进行相应的比较准确的杂质定位。

其他杂质只能通过EP混
合对照品于标准图谱比较进行归属定位。

3.2 色谱柱的选择
比较Sepax technologies C18和YMC C18的测定结果，发现Sepax technologies C18色谱柱的克拉霉素峰及检出的杂质峰个数，数量与YMC C18
色谱柱的结果基本一致，但杂质G与杂质H峰出峰顺序颠倒，故规定了色谱柱的品牌型号为YMC C18(250mm×4.6mm,5μm)。

YMC C18是专门为分离碱性化合物设计，克拉霉素及其特殊杂质均为碱性化合物，在用YMC C18分析时，克拉霉素及其各特殊杂质可以得到较好的分离和重现性，在流动相条件一致的情况下，重现性很好，有利于克拉霉素有关物质的质量控制。

而Sepax technologies C18色谱柱则对有机酸分子有较好的分离效果。

3.3 供试品溶液的制备
克拉霉素干混悬剂含有香精，矫味剂等多种辅料，会干扰有关物质测定，因而利用
克拉霉素属弱碱性化合物，溶于有机溶剂(乙腈)，在水中不溶的特点，采用碱性磷酸盐缓冲液洗涤样品，除去大部分矫味剂和水溶性辅料，再用乙腈溶解克拉霉素及其杂质。

通过多次碱性磷酸盐淋洗液离心除去样品中的辅料，在未来质量控制中，在厂家不能提供辅料的情况下，可以控制其有关物质。

其供试品溶液的制备过程较复杂，有振揺，离心，超声等多项步骤，因此，实验中注意每步操作，避免因损失样品或样品处理不完全等原因影响实验结果。

参考文献
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