用于分枝杆菌分子生物学鉴别诊断的靶序列

Ｇｅｎｅｒａｌ Ｈｏｓｐｉｔａｌ ｏｆ Ｎａｎｊｉｎｇ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｃｏｍｍａｎｄ，ＰＬＡ，Ｎａｎｊｉｎｇ ２１０００２，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ ａｕｔｈｏｒ：ＬＩ Ｚｉ—ｌｉｎｇ，Ｅｍａｉｌ：ｌｚｌｈａｐｐｙｌ９５１２００４６１＠１ ６３．∞研 ［Ａｂｓｔｒａｃｔ］ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｈａｓ ｂｅｅｎ ｕｓｅｄ ｉｎ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．
．综述．
用于分枝杆菌分子生物学鉴别诊断的靶序列
张峰李子玲施毅
【摘要】分子生物学技术已应用于分枝杆菌感染的辅助诊断。目前分子鉴定靶序列主要有４种：即 ｈｓｐ６５基因、ｄｎａＪ基因、１６ＳｒＲＮＡ基因和１６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡ间隔区序列。其他一些序列如ＩＳ６１ １０、间隔子寡核 苷酸、ｒｐｏＢ基因和ｍＲＮＡ。属于种特异性或种群特异性ＤＮＡ序列。可用于结核分枝杆菌的鉴别诊断和耐 药性检测。本文对这些ＤＮＡ序列在分枝杆菌鉴定中的应用作一综述。
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分枝杆菌。Ｄａｌｅｙ等对８４份标准菌株标本、临床标 本进行１６ＳｒＲＮＡ扩增测序分析，并与高效液相分 析结果对比，结果显示１６ＳｒＲＮＡ测序分析特异性 敏感性明显高于高效液相分析检测乜］。虽然已有临 床试验显示上述方法有较高的敏感性和特异性，但 临床上基于１６ＳｒＲＮＡ的结核分枝杆菌分子生物学 检测应用于抗酸染色阴性的标本是有争议的，美国 食品与药物管理局只批准此试验用于近１２个月内 未接受抗痨治疗的抗酸染色镜检阳性患者口］。 １．２ ６５ ０００热休克蛋白（ｈｓｐ６５）基因ｈｓｐ６５是分 枝杆菌的一个主要免疫反应蛋白，广泛地存在于分 枝杆菌中，此抗原既含有分枝杆菌菌种独特的表位， 也含有不同分枝杆菌共同的表位，其核苷酸序列的 多态性总体上大于１６ＳｒＲＮＡ基因的多态性。利用 ＰＣＲ扩增分枝杆菌基因组的３９６～８３６位的ＤＮＡ 后，可对扩增片段内３６０ ｂｐ高变区序列进行分析。 据报道此序列有１０５个等位基因，分别代表３６种分 枝杆菌，有１（】种分枝杆菌有不止一个等位基因。 ＰＣＲ－ＲＦＩ。Ｐ分析也表明，ｈｓｐ６５基因有种、亚种特异 性的等位基因存在。Ｈｏ等用ＰＣＲ扩增１２种分枝 杆菌的ｈｓｐ６５基因，然后用限制性内切酶ＨａｅⅢ酶 切，对酶切片段进行毛细管电泳分析，能清晰的鉴定 出结核分枝杆菌、堪萨斯分枝杆菌、龟分枝杆菌、脓 肿分枝杆菌、蟾蜍分枝杆菌、猿分枝杆菌等１２种分 枝杆菌［４］。除测序和ＰＣＲ－ＲＦＬＰ分析分枝杆菌的 ｈｓｐ６５基因外，利用ＤＮＡ探针杂交的方法也用于鉴 定非结核分枝杆菌到种的水平。Ａｎｄｒｅｙ等对临床 病理标本提取分枝杆菌ＤＮＡ，经ＰＣＲ扩增后对 ｈｓｐ６５和插入序列（ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ，ＩＳ）６１１０序 列分析以鉴别结核分枝杆菌与鸟分枝杆菌，鉴别结 果与传统方法一致，但效率大大提高拍］。然而无论 是测序分析还是ＲＦＩ。Ｐ分析ｈｓｐ６５基因，都不能将 结核分枝杆菌复合群鉴定到种的水平。 １．３’ｄｎａＪ基因ｄｎａＪ基因编码应激蛋白，是 ｈｓｐ４０家族成员之一，在细菌菌种中具有高度的保 守性，可用于多种不同种属细菌的研究。ｄｎａＪ基因 序列既用于分枝杆菌的菌种鉴定，也可以用于推导 分枝杆菌的种系发生关系。就缓慢生长分枝杆菌而 言，根据ｄｎａＪ基因序列推导的种系发生树状图，与 １６ＳｒＲＮＡ基因推导的结果比较，ｄｎａＪ．基因和菌株 表型特征更一致。在ｄｎａＪ基因的ＰＣＲ扩增产物内 有种特异的限制性酶切位点，用ＰＣＲ～ＲＦＩ。Ｐ能快速 有效地将结核分枝杆菌复合群鉴定开来。用ＳｒｎａＩ、 ＮａｅＩ、ＨｉｎｆＩ和ＦｏｋＩ四种限制性内切酶能将１３种 非结核分枝杆菌分成９组，能将鸟分枝杆菌和胞内
１３０１：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１６７３－４３６Ｘ．２００９．０１７．０１２ 作者单位：２１０００２第二军医大学南京ｌ临床医学院（南京军区 南京总医院）呼吸内科 通信作者：李子玲，Ｅｍａｉｌ：ｌｚｌｈａｐｐｙｌ９５１２１）０４６Ｉ＠１６３．ｃｏｒｎ
万方数据
１６ＳｒＲＮＡ进行扩增检测是较为成熟的分枝杆菌的 分子生物学检测方法，因为：①其分子结构具有高度 保守的特性，只在某些位置有少量的核苷酸序列改 变，而这些位置的改变有分枝杆菌属或种特异性；② 许多分枝杆菌的１６ＳｒＲＮＡ基因序列已测定完成； ③长度适中，基因在细胞内有多拷贝（１ ０００－ 】００ ０００）。１６ＳｒＲＮＡ基因序列内有几个高变区，分 枝杆菌的１６ＳｒＲＮＡ基因测序表明大部分已知的分 枝杆菌在高变区Ａ（相当于Ｅ．ｃｏｌｉ １６ＳｒＲＮＡ基因 的１２９—２６４位）有一个特征性的序列。将被检分枝 杆菌的序列和已知的特异性序列比较，就可以准确 地鉴定分枝杆菌。但是１６ＳｒＲＮＡ有其局限性，部 分分枝杆菌不能鉴别至种的水平，例如结核分枝杆 菌复合群的１６ＳｒＲＮＡ基因序列是相同的，堪萨斯 分枝杆菌和胃分枝杆菌有相同的１６ＳｒＲＮＡ序列， 溃疡分枝杆菌和海分枝杆菌的１６ＳｒＲＮＡ基因的特 征性序列只有两处的单核苷酸不同，只测定 １６ＳｒＲＮＡ序列不能将这两种菌鉴定出来。用聚合 酶链式反应一限制性内切酶片段长度多态性方法 （ＰＣＲ—ＲＦＬＰ）分析分枝杆菌的１６ＳｒＲＮＡ基因，可 鉴定分枝杆菌至种或亚种的水平，或根据１６ＳｒＲＮＡ 基因中离变区的序列设计出一系列的种特异性的探 针，制成高密度寡核苷酸芯片也可快速鉴别不同的
Ｈｓｐ６５ ｇｅｎｅ，ｄｎａＪ ｇｅｎｅ，１６ＳｒＲＮＡ ａｎｄ １６Ｓ－２３ＳｒＲＮＡ ａｒｅ ｗｉｄｅｌｙ ｕｓｅｄ ａｓ ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ．ＩＳ６１ １０ ｇｅｎｅ， ｓｐａｃｅｒ ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ，ｒｐｏＢ ｇｅｎｅ ａｎｄ ｍＲＮＡ ａｒｅ ｇｅｎｕｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｏｒ ｓｐｅｃｉｅｓ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ，ｗｈｉｃｈ ｃａｒｌ ｂｅ ｕｓｅｄ ｉｎ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ａｎｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｄｒｕｇ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ。Ｔｈｅ ｐａｐｅｒ
【关键词】分枝杆菌；分子生物学；鉴别诊断
Ｔａｒｇｅｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｅｄ ｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ＺＨＡＮＧ Ｆｅｎｇ·ＬＩ
Ｚｉ—ｌｉｎｇ，ＳＨＩ ｈ．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅ Ｓｅｃｏｎｄ Ｍｉｌｉｔａｒｙ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／Ｎａｎｊｉｎｇ
ｓｕｍｍａｒｉｓｅ ｔｈｅ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｕｓｅｄ ｆｏｒ ｄｉｓｃｒｉｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ． ［Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓｌ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｂｉｏｌｏｇｙ；Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ
结核病疫情在全球范围内呈上升趋势，第四次 全国流行病学调查示我国现有结核病患者约２００万 人，我国是结核病流行最严重的国家之一。近年来， 非结核分枝杆菌感染人数有所增加，其ｌ临床症状和 影像学表现与结核相似，难以鉴别，而且多数非结核 分枝杆菌对抗结核药物有天然耐药性，因此正确鉴 定结核分枝杆菌和非结核分枝杆菌对于疾病诊断和 治疗至关重要。传统的生物学鉴定方法以细菌学检 查为主，但有耗时长、操作繁琐、不易标准化等缺点。 近年来，随着分子生物学技术的进展，已经应用一些 分枝杆菌特异性的ＤＮＡ片段进行分枝杆菌的鉴 别，有较高的敏学的鉴别诊断进展 综述如下。 １分枝杆菌属、种的鉴定序列 １．１ １６ＳｒＲＮＡ分枝杆菌的１６ＳｒＲＮＡ基因序列 通常存在于所有结核分枝杆菌复合群中，已被建议 作为检测结核分枝杆菌的一个基因靶，针对