单抗讲义

合集下载
  1. 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
  2. 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
  3. 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。

一 ,抗原提纯与动物免疫
对抗原的要求是纯度越高越好 1 细胞抗原-----可取 ×107个细胞作腹腔免疫 细胞抗原 可取1× 可取 2 可溶性抗原 可溶性抗原-----需加完全福氏佐剂并经充分乳化 需加完全福氏佐剂并经充分乳化 3 聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原 聚丙烯酰胺电泳纯化的抗原-------可将抗原所在的电泳条带 可将抗原所在的电泳条带 切下, 研磨后直接用以动物免疫. 切下, 研磨后直接用以动物免疫. 选择BALB/c健康小鼠,鼠龄在8~12周,雌雄不限.同 选择 健康小鼠,鼠龄在 ~ 周 雌雄不限. 健康小鼠 时免疫3~ 只小鼠 只小鼠. 时免疫 ~4只小鼠.
六,单克隆抗体的鉴定
1. 抗体特异性的鉴定:方法可用 抗体特异性的鉴定:方法可用ELISA法. 法 2. McAb的Ig类与亚类的鉴定 的 类与亚类的鉴定 3. McAb中和活性的鉴定:用动物的或细胞 中和活性的鉴定: 中和活性的鉴定 的保护实验来确定McAb的生物学活性.例如如果 的生物学活性. 的保护实验来确定 的生物学活性 确定抗病毒McAb的中和活性,则可用抗体和病毒 的中和活性, 确定抗病毒 的中和活性 同时接种于易感的动物或敏感的细胞, 同时接种于易感的动物或敏感的细胞,来观察动物 或细胞是否得到抗体的保护. 或细胞是否得到抗体的保护. 4. McAb识别抗原表位的鉴定:用竞争结合 识别抗原表位的鉴定: 识别抗原表位的鉴定 试验,测相加指数的方法,测定McAb所识别抗原 试验,测相加指数的方法,测定 所识别抗原 位点,来确定McAb的识别的表位是否相同. 的识别的表位是否相同. 位点,来确定 的识别的表位是否相同 5. McAb亲和力的鉴定:用ELISA或RIA竞 亲和力的鉴定: 亲和力的鉴定 或 竞 争结合试验来确定McAb与相应抗原结合的亲和力. 与相应抗原结合的亲和力. 争结合试验来确定 与相应抗原结合的亲和力
八:细胞的冻存与复苏----慢冻快复 (一)保存
连续传代的过程中,可能产生突变或染色体的漂移丢失产生抗体的特性. 所以必须冷藏保存一部分.保存方法如下: 1.材料 (1) 细胞:取对数生长期的细胞. (2) 10%二甲基亚砜保护液:含10%二甲基亚砜,20%灭活胎牛血清,70 %RPMI—1640液. (3) 20%FCS—1640培养液:含青霉素100U/ml,链霉素100g/ml. (4) 灭菌的2ml安瓶等 2.操作方法 (1) 去掉细胞培养瓶中的旧的培养液,加入10%FCS—1640液,使细胞悬 浮. (3) 1 000r/min离心10min,去上清.细胞沉淀用10%二甲基亚砜保护液制 成悬液. (4) 用注射器将细胞分装安瓶,每瓶0.5ml~1.0ml,熔封安瓶. (5) 放4℃ 2h. (6) 放液氮罐气态部分(-70℃)15h. (7) 转入液氮部分.
三,细胞融合
洗涤和并计数将两种细胞混合后加PEG(聚乙二醇) 分别收集 洗涤和并计数将两种细胞混合后加 使细胞彼此融合.其后培养液稀释PEG,消除 的作用. 使细胞彼此融合.其后培养液稀释 ,消除PEG的作用. 的作用 将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养. 将融合后的细胞适当稀释,分置培养板孔中培养. 注意问题 细胞比例:常用1:4的比例.应保证两种细胞在融合前都具 的比例. ①细胞比例:常用 的比例 有较高活性. 有较高活性. 反应时间:轻柔操作.在两种细胞的混合细胞悬液中, ②反应时间:轻柔操作.在两种细胞的混合细胞悬液中,第 1min滴加1ml培养液;第2min滴加4ml培养液,尔后 滴加1 培养液 培养液; 滴加4 培养液 培养液, 滴加 滴加 加培养液2 3min加培养液20ml. 加培养液 . 培养液的成分:对融合细胞,良好的培养液尤其重要, ③培养液的成分:对融合细胞,良好的培养液尤其重要,其 中的小牛血清,各种离子和营养成分均需严格配制. 中的小牛血清,各种离子和营养成分均需严格配制.如融 合效率降低,应随时核查培养基情况. 合效率降低,应随时核查培养基情况.
主要步骤包括: 主要步骤包括: (1)抗原制备; )抗原制备; (2)免疫动物; )免疫动物; (3)免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备; )免疫脾细胞和骨髓瘤细胞的制备; (4)细胞融合; )细胞融合; (5)杂交瘤细胞的选择培养; )杂交瘤细胞的选择培养; 6)杂交瘤细胞的筛选; (6)杂交瘤细胞的筛选; (7)杂交瘤细胞的克隆化; )杂交瘤细胞的克隆化; (8)单克隆抗体的检定; )单克隆抗体的检定; (9)单克隆抗体的大量制备. )单克隆抗体的大量制备.
四,HAT选择杂交瘤 选择杂交瘤
选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞, 选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞,一 目的是筛选融合的杂交瘤细胞 般采用HAT选择性培养基.在HAT培养基中,未融合 选择性培养基. 培养基中, 般采用 选择性培养基 培养基中 的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤 鸟嘌呤-磷酸核糖转移 次黄嘌呤-鸟嘌呤 的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤 鸟嘌呤 磷酸核糖转移 不能利用补救途径合成DNA而死亡. 未融合的 而死亡. 酶,不能利用补救途径合成 而死亡 淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤 磷酸核糖转移酶, 鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶 淋巴细胞虽具有次黄嘌呤 鸟嘌呤 磷酸核糖转移酶, 但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡. 但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡. 只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄 嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶, 嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶,并具有骨髓瘤细胞能无 限增殖的特性,因此能在HAT培养基中存活和增殖. 培养基中存活和增殖. 限增殖的特性,因此能在 培养基中存活和增殖
单抗的特点
1.高度均质性 高度均质性-------始于一个 细胞的 始于一个B细胞的 高度均质性 始于一个 单克隆系,均质 单克隆系 均质 2.高度特异性-------针对单个抗原决定 2.高度特异性-------针对单个抗原决定 高度特异性 簇反应,一般无交叉反应 簇反应 一般无交叉反应 3.来源稳定 产量大 来源稳定,产量大 来源稳定
七,单克隆抗体的大量生产
体内接种杂交瘤细胞,制备腹水. 体内接种杂交瘤细胞,制备腹水. 腹腔注射1× 个杂交瘤细胞, 腹腔注射 ×106个杂交瘤细胞,接种细胞 7~10天后可产生腹水,密切观察动物的健康状 天后可产生腹水, ~ 天后可产生腹水 况与腹水征象,待腹水尽可能多, 况与腹水征象,待腹水尽可能多,而小鼠频于死 亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中, 亡之前,处死小鼠,用滴管将腹水吸入试管中, 一般一只小鼠可获1~ 腹水. 一般一只小鼠可获 ~10ml腹水.也可用注射器 腹水 抽取腹水,可反复收集数次. 抽取腹水,可反复收集数次.
单克隆抗体
Monoclonal Antibody
单克隆抗体(McAb) 单克隆抗体
1975年英国科学家 1975年英国科学家Milstein和Kohler将产生抗体 年英国科学家 和 将产生抗体 的淋巴细胞同肿瘤细胞融合,成功建立了单克隆抗 淋巴细胞同肿瘤细胞融合, 融合 体技术,而获得 年诺贝尔医学和生理学奖. 体技术,而获得1984年诺贝尔医学和生理学奖. 年诺贝尔医学和生理学奖 每个B淋巴细胞仅专一地产生,分泌一种针对某 每个 淋巴细胞仅专一地产生, 淋巴细胞仅专一地产生 种抗原决定簇的特异性抗体, 种抗原决定簇的特异性抗体,而肿瘤细胞可以无限 增殖, 增殖,因此杂交瘤细胞可在体外培养或移植到体内 条件下分泌大量结构与特性相同的高纯度抗体. 条件下分泌大量结构与特性相同的高纯度抗体. 单克隆抗体技术的最主要优点是可以用不纯的抗 原分子大量制备纯一的单克隆抗体. 原分子大量制备纯一的单克隆抗体.

①探讨蛋白质的精细结构; 探讨蛋白质的精细结构; ③组织相容性抗原; 组织相容性抗原;

②淋巴细胞亚群的表面新抗原分析; 淋巴细胞亚群的表面新抗原分析;
④激素和药物的放射免疫(或酶免疫)分析; 激素和药物的放射免疫(或酶免疫)分析; ⑤肿瘤的定位和分类; 肿瘤的定位和分类; ⑥纯化微生物和寄生虫抗原; 纯化微生物和寄生虫抗原; 化学疗法( 导弹"疗法, ⑦免疫-化学疗法("导弹"疗法, 利用单克隆抗体与靶细 免疫 化学疗法 胞特异性结合, ).可直接用于人类 胞特异性结合,将药物带至病灶部 位).可直接用于人类 疾病的诊断,预防, 制的研究. 疾病的诊断,预防,治疗以及免疫机 制的研究.
单 克 隆 抗 体 示 意 图
杂 交 瘤 细 胞 产 生
单抗与多抗
性 质 抗体含量 无关的Ig 无关的 其它血清蛋白 Ag-Ab结合 结合 特异性亲和力的重复性 与其它抗原的交叉反应 免疫球蛋白的种类与亚类 免疫球蛋白的物理性质 常规血清抗体 少 μg/ml 多 有 免疫原的全部成分的全部 抗原决定簇 不同批号间有变化 与带有共同抗原决定簇的 抗原有部分交叉 完全是混合的 典型光谱 单克隆抗体 多 mg/ml 少或几乎无 少,培养物上清常有10 培养物上清常有 %胎牛血清 免疫原中的一种成分的 一个抗原决定簇 无变化 一般无. 一般无.结合到共同决 定簇则是完全的 只是一种或几种 抗体的单一性质
本身不分泌任何免疫球蛋白重链或轻链.融合细 胞应选择处于对数生长期,细胞形态和活性佳的细胞.
2
饲养细胞
在体外培养条件下,细胞的生长依赖适当的细胞 密度,因而,在培养融合细胞或细胞克隆化培养时, 还需加入饲养细胞(feedercell).常用的为小鼠的腹 腔细胞. 在制备饲养细胞时,切忌针头刺破动物的消化器 官,否则所获细胞会有严重污染.
H-次黄嘌呤 A-氨基喋呤 T-胸腺嘧啶核苷
五,杂交瘤细胞的克隆化 有限稀释法
① 制备饲养细胞悬液(同融合前准备) ② 阳性孔细胞的计数 ③ 取130个细胞放入6.5ml含饲养细胞完全培养液,即20个 细胞/ml,100l/孔加A,B,C三排为每孔2个细胞.余下 2.9ml细胞悬液补加2.9ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数为10 个/ml,100l/孔加D,E,F三排,为每孔1个细胞.余下 2.2ml细胞悬液补加2.2ml含饲养细胞的完全培养液,细胞数5 个/ml,100l/孔,加G,H两排,为每孔0.5个细胞. ④ 培养4~5天后,在倒置显微镜上可见到小的细胞克隆,补 加完全培养液200l/孔. ⑤ 第8~9天时,肉眼可见细胞克隆,及时进行抗体检测.
小鼠腹腔巨噬细胞的制备 浸泡于75%酒精,消毒3~ 分钟 拉颈处死 浸泡于 %酒精,消毒 ~5分钟 ↓ 用无菌剪刀剪开皮肤, 用无菌剪刀剪开皮肤,暴露腹膜 ↓ 用无菌注射器注入6~ 用无菌注射器注入 ~8ml培养液 培养液 ↓ 反复冲洗, 反复冲洗,吸出冲洗液 ↓ 放入10ml离心管,1200转/分离心 ~6分钟 离心管, 放入 离心管 转 分离心5~ 分钟 ↓ 的培养液混悬,调整细胞数1× 5 用20%小牛血清 %小牛血清(NCS) 的培养液混悬,调整细胞数 ×105 /ml ↓ 加入96孔板 孔板, 加入 孔板,100l/孔 / ↓ 放入37℃ 放入 ℃ 孵箱培养
免疫过程因动物,抗原形式,免疫途径不同而异, 免疫过程因动物,抗原形式,免疫途径不同而异,以获得 高效价抗体为最终目的.免疫间隔一般2~3周.共计三到四次. 高效价抗体为最终目的.免疫间隔一般 ~ 周 分离脾细胞融合前3~ 天加强免疫一次 天加强免疫一次. 分离脾细胞融合前 ~4天加强免疫一次.
二 , 三种细胞 1 Sp2/0(骨髓瘤细胞 骨髓瘤细胞) 骨髓瘤细胞
3 免疫脾细胞
免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中B淋 免疫脾细胞指的是处于免疫状态脾脏中 淋 巴母细胞.一般取最后一次加强免疫3天以后 巴母细胞.一般取最后一次加强免疫 天以后 的脾脏,制备成细胞悬液, 的脾脏,制备成细胞悬液, 脾细胞悬液的制备: 脾细胞悬液的制备:在无菌条件下取出脾 用不完全的培养液洗一次, 脏,用不完全的培养液洗一次,置平皿中不锈 钢筛网上, 钢筛网上,用注射器针芯研磨成细胞悬液后计 数.一般免疫后脾脏体积约是正常鼠脾脏体积 左右. 细胞数为2 的2倍,细胞数为2×108左右.
相关文档
最新文档