干露胁迫对刺参体壁非特异性免疫特征的分析

干露胁迫对刺参体壁非特异性免疫特征的分析
一般来说,水生生物在其生活史中,主要生活在水体里。

但是对于潮间带生物来说,可能会经常面临不同时间的离水环境条件,而多数情况下,这种干露一般很少对其生命活动造成较大伤害。

然而,大部分水生生物一般不能直接利用空气中的氧气,这种短时间的干露条件对于其体温的维持和氧气的获得必然会产生很大影响。

这样,在干露条件下,这些水生生物必须通过一系列机体生理生化活动的调整来适应环境的变化。

刺参(Apostichopus japonicus),属于棘皮动物门(Echinodermata)、海参纲(Holothuroidea),具有很高的营养保健和医用价值,是我国北方重要的增养殖种类之一。

在养殖生产过程中,刺参经常会遭遇干露条件,主要有两种情况:一种是在春秋季节,一定的水温条件下,许多刺参会爬到池塘浅水处,经常因换水过程或池塘的渗漏而干露在空气中一段时间;另一种是在干法运输过程中,刺参苗种和成参也可能经历一段时间长短不一的干露过程。

尽管国内外对于刺参的生理生态学已有很多研究,但对于干露状态下刺参的非特异性免疫能力的状况尚未见研究。

刺参缺乏抗体介导的免疫反应,主要以非特异性免疫来识别异己物质、抵御病原体的侵袭。

在逆境胁迫下会产生大量的活性氧,进而导致机体生理机能的损伤和免疫机能的破坏。

为了及时消除病原感染和环境胁迫的影响,维持细胞的正常代谢,生物体经过长期进化形成了完善而复杂的酶类和非酶类抗氧化保护系统。

酸性磷酸酶(ACP)和碱性磷酸酶(AKP)是动物体内参与免疫防御等活动的两种重要水解酶。

超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)是抗氧化系统的关键酶,可用来评判机体的非特异性免疫能力。

总抗氧化能力(T-AOC)是衡量机体抗氧化系统功能状况的综合性指标[6-8]。

MDA则是细胞氧化代谢产物,其含量高低反应机体细胞受自由基攻击的程度[9-11]。

本研究以刺参幼参为实验材料,研究了不同温度条件下干露对其体壁水解酶系统和抗氧化酶系统相关指标的影响,旨在研究干露胁迫对刺参免疫能力的影响,探讨刺参对干露胁迫适应机制,以期丰富刺参的生理生态学特征,为刺参运输方法的完善提供参考。

1材料与方法
实验材料来源与驯化
刺参购于青岛即墨田横镇泊子村海参养殖基地。

刺参运回后在600 L
玻璃钢水槽中驯化 20 d之后,选取体长、体重相近的健康刺参进行实验[平均体
重为(50±5)g]。

暂养过程中,水温控制在(17±)℃,盐度(30±1)‰,海水溶解氧大于 mg/L,海水中氨的浓度低于 mg/L。

光照周期14L∶10D。

养殖用水为沙滤自然海水,每天换水 1/2并保持连续充气。

按刺参体重的10%投喂配合饲料。

温度驯化在光照培养箱中进行,以每天升高或降低℃的速度调整到各
需要温度,3 d后开展实验,驯化期间光照周期为14L∶10D,连续充气,每2 d换水1/2,所换水为相同温度的水。

实验设计
研究设置了6个不同的干露温度,即4、8、12、16、20和24 ℃,每个
处理各包含30头刺参,平均体重为(50±5)g。

刺参放在带孔泡沫隔板上,于可控温的光照培养箱内进行实验,光照强度为(80±5)lx。

同时另取17 ℃暂养的刺参30头,将其直接放到4 ℃的光照培养箱中,用于模拟刺参运输过程。

取样和测定方法
取样方法分别于干露后0、2 、4、8 、12 和24 h进行取样。

用医用
纱布吸干刺参的体表水分后,在冰盘上将其迅速解剖,剪取刺参体壁,置于5 mL
离心管中,然后放入液氮,最后转入-80 ℃超低温冰箱中保存。

每个处理每次随机取4头参进行样品采集,实验期间共取样6次。

免疫指标测定方法实验主要测定了体壁中酸性磷酸酶(ACP)、碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)的活性,以及微量丙二醛(MDA)含量和总抗氧化能力(T-AOC)等。

取~ g体壁组织样品,剪碎,加入4倍体积的冰冷生理盐水(%),制成20%匀浆,于4 ℃、10 000 g下离心20 min,收集上清液分装待测。

采用南京建成生物工程研究所试剂盒进行测定,相关免疫指标的测定方法参考试剂盒说明书进行。

酸性磷酸酶(ACP):以每克组织蛋白在37 ℃与基质作用30 min产生1 mg 酚为一个活性单位,以U/gprot表示。

碱性磷酸酶(AKP):以每克组织蛋白在37 ℃与基质作用15 min产生1 mg 酚为一个活性单位,以U/gprot表示。

超氧化物歧化酶(SOD):以每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为一个SOD活性单位,以U/mgprot表示。

过氧化氢酶(CAT):以每毫克组织蛋白每秒钟分解1 μmol的
的量为一个活性单位,以U/mgprot表示。

微量丙二醛(MDA):以每毫克蛋白所含的纳摩尔数为一个单位,以
nmol/gprot表示。

总抗氧化能力(T-AOC):以在37 ℃时,每分钟每毫克组织蛋白使反应体
系的吸光度值增加时,为一个总抗氧化能力单位。

血清中蛋白含量的测定采用考马斯亮蓝法测定,以牛血清白蛋白(AMRESCO公司)为标准蛋白。

数据处理
实验数据以平均数±标准误(Mean±)表示。

利用 SPSS 进行Two-way ANOVA分析以确定干露温度和干露时间的交互作用,同时对不同干露时间或干露
温度间的实验指标进行Duncan多重比较分析(One-way ANOVA),以P<为差异显着水平。

2实验结果
干露对刺参成活率的影响
不同干露温度下,刺参的成活率见表1。

由表可见,经过24 h干露胁迫,在温度20 ℃和24 ℃处理组中的刺参全部死亡,其余处理组的刺参存活率为100%。

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干露对刺参体壁酸性磷酸酶活性的影响
不同温度干露条件下,刺参体壁中ACP活性随时间的变化见图1。

可以
看出,刺参体壁ACP活性高低与干露温度和时间直接相关,总体随干露温度升高
表现出明显的上升趋势。

除了20和24 ℃,ACP活性随干露时间的持续均呈显着的逐渐下降趋势(P<)。

其中,4和8 ℃处理组刺参体壁ACP活性随时间延长一直降低,直到24 h时降低到最低值;12、16 ℃和突变处理组刺参体壁ACP活性在4 h有所上升,然后再次降低直到实验结束;。