一种戊糖乳杆菌、应用及发酵面包的制备方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010179378.8
(22)申请日 2020.03.16
(71)申请人 沈阳师范大学
地址 110034 辽宁省沈阳市黄河北大街253
号（道义开发区）
(72)发明人 赵秀红　赵闪闪　姜忠丽　代岚　
肖志刚　
(74)专利代理机构 沈阳维特专利商标事务所
(普通合伙) 21229
代理人 甄玉荃
(51)Int.Cl.
C12N 1/20(2006.01)
A21D 8/04(2006.01)
C12R 1/225(2006.01)
(54)发明名称
一种戊糖乳杆菌、应用及发酵面包的制备方
法
(57)摘要
本发明公开了一种戊糖乳杆菌、应用及发酵
面包的制备方法，其中，戊糖乳杆菌从酸汤子中
提取获得，在发酵面包的制备方法中，通过在面
粉中添加酵母菌和接种戊糖乳杆菌的酸面团，实
现酵母菌与戊糖乳杆菌混菌发酵，从而提高面包
中氨基酸含量，有利于促进面筋蛋白网络聚合体
的形成，提高面筋的伸展性，使得最终制得的面
包具有感官品质好、
储藏稳定性高等优点。

权利要求书1页 说明书10页 附图3页CN 111363697 A 2020.07.03
C N 111363697
A
1.一种戊糖乳杆菌,其特征在于，所述戊糖乳杆菌按照如下步骤提取获得：
将酸汤子用无菌生理盐水梯度稀释为1×10－4～1×10－7mol/l后，分别涂布于添加碳酸钙的固体培养基上，进行培养；
将固体培养基上菌落形态及溶钙圈不同的菌在MRS琼脂平板上重复划线分离，直至分离出纯种；
对分离的纯化菌进行革兰氏染色和接触酶试验，将革兰氏阳性且接触酶阴性的菌，通过分子生物学鉴定，获得戊糖乳杆菌。

2.根据权利要求1所述戊糖乳杆菌,其特征在于，所述酸汤子涂布于添加碳酸钙的固体培养基上，在温度为37℃恒温条件下培养48-72h。

3.根据权利要求1所述戊糖乳杆菌,其特征在于，按重量计，所述固体培养基上碳酸钙的含量为2％。

4.一种权利要求1-3所述戊糖乳杆菌的应用，其特征在于，将所述戊糖乳杆菌用于发酵食品的制备中。

5.一种发酵面包的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
1)将面包粉、酸面团、绵白糖、食盐、酵母菌以及水，放入和面机中搅拌至成膜后，加入黄油，搅拌均匀，得面团；
2)将所述面团静置松弛后，均匀分成小块，进行搓圆、整形、醒发，得面包坯；
3)将所述面包坯放入烘烤箱内烘烤，将烘烤后面包冷却，得成品；
其中，步骤1)所述酸面团为含有权利要求1-3所述戊糖乳杆菌的酸面团。

6.根据权利要求5所述发酵面包的制备方法，其特征在于，步骤1)中所述酸面团的具体制备步骤如下：
将权利要求1-3所述的戊糖乳杆菌在无菌条件下接种于MRS液体培养基中，于37℃条件下活化两次后，以2％的接种量将活化后的戊糖乳杆菌接种到50mL的MRS液体培养基中，在37℃下，培养8h；
将面粉与无菌水按照质量比1：1混合后，将戊糖乳杆菌以108log cfu/g面粉的接种量接种，制作酸面团；
将所述酸面团置于醒发箱中醒发至pH＝3.7～4.1，备用。

7.根据权利要求6所述发酵面包的制备方法，其特征在于，将所述酸面团置于醒发箱中，在温度为30℃的条件下，醒发至pH＝3.7～4.1，备用。

8.根据权利要求6所述发酵面包的制备方法，其特征在于，步骤2)中所述醒发在温度为30℃，相对湿度为80％的条件下，醒发80min。

9.根据权利要求6所述发酵面包的制备方法，其特征在于，步骤3)中烘烤的条件为上下火180℃，烘烤20min。

权　利　要　求　书1/1页CN 111363697 A
一种戊糖乳杆菌、应用及发酵面包的制备方法
技术领域
[0001]本发明公开涉及乳酸菌及面包制备的技术领域，尤其涉及一种戊糖乳杆菌、应用及发酵面包的制备方法。

背景技术
[0002]戊糖乳杆菌(Lactobacillus pentosus)是乳酸菌中的一种，在分类学中归于硬壁菌门(F i r m i c u t e s)，杆菌纲(B a c i l l i)、乳杆菌目(L a c t o c o c c u s)、乳杆菌科(Lactobacillaceae)、乳杆菌属(Lactobacillus)。

L.pentosus最初被鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，而后利用recA基因将其重新划分为L.pentosus。

1894年，FRED E等从德国酸菜(Sauerkraut)中分离鉴定出L.pentosus，发现其在发酵肉制品、发酵谷物蔬菜和乳制品等中广泛存在。

由于L.pentosus具有特殊的抗菌和益生功能等，使其不仅在食品发酵和保藏过程中起到了重要的作用，而且对人体健康产生促进作用。

[0003]目前，国内外研究者对戊糖乳杆菌生理生化性质、生物学功能及其在功能食品开发、橄榄发酵食品和生物表面活性剂合成方面做了大量工作，并且获得了很多有意义的研究成果，拓宽了其在食品工业中的应用前景。

然而大规模工业化的应用实例却很少，仍有许多问题需要进一步深入研究，其中最突出的问题是发酵食品中戊糖乳杆菌与其他微生物相互作用的影响。

[0004]中国传统发酵食品历史悠久，种类繁多。

发酵食品独特的风味和多种保健功能与发酵过程中多种微生物息息相关。

酸面团发酵剂是一种古老而传统的面食发酵种，其应用早于烘焙酵母。

在国外多应用于面包的制作，在中国可用来制作馒头、馕等具有地区特色的发酵面食品。

[0005]传统发酵酸面团中主要采用旧金山乳杆菌，短乳杆菌和植物乳杆菌，而工业化的发酵剂中主要是罗伊氏乳杆菌以及食淀粉乳杆菌。

与西方酸面团相似，我国传统面食发酵剂中也存在着丰富的乳酸菌，并发挥着重要的作用。

从我国不同地区传统面食发酵剂中分离鉴定的乳酸菌有23种，以植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)为主。

此外，韩春然等还从酸面团中分离出几种醋酸菌种如：醋化酸杆菌、巴氏醋杆菌、汉氏醋杆菌及液化醋杆菌。

然而，上述的乳酸菌在面包制备过程中仍达到不到人们精益求精的品质效果。

[0006]因此，如何研发一种关于戊糖乳杆菌的分离方法以及面包的制作方法，成为人们亟待解决的问题。

发明内容
[0007]鉴于此，本发明提供了一种戊糖乳杆菌、应用及发酵面包的制备方法，以在提出一种新的获取戊糖乳杆菌方法的同时，还能获得了一种制备发酵面包的新方法。

[0008]本发明一方面提供了一种戊糖乳杆菌，该戊糖乳杆菌按照如下步骤提取获得：[0009]将酸汤子用无菌生理盐水梯度稀释为1×10－4～1×10－7mol/l后，分别涂布于添加碳酸钙的固体培养基上，进行培养；
[0010]将固体培养基上菌落形态及溶钙圈不同的菌在MRS琼脂平板上重复划线分离,直至分离出纯种；
[0011]对分离的纯化菌进行革兰氏染色和接触酶试验，将革兰氏阳性且接触酶阴性的菌，通过分子生物学鉴定，获得戊糖乳杆菌。

[0012]优选，所述酸汤子涂布于添加碳酸钙的固体培养基上，在温度为37℃恒温条件下培养48-72h。

[0013]进一步优选，按重量计，所述固体培养基上碳酸钙的含量为2％。

[0014]本发明另一方面还提供了一种戊糖乳杆菌的应用，具体而言，将所述戊糖乳杆菌应用于发酵食品的制备中。

[0015]此外，本发明还提供了一种发酵面包的制备方法，该制备方法，包括如下步骤：[0016]1)将面包粉、酸面团、绵白糖、食盐、酵母菌以及水，放入和面机中搅拌至成膜后，加入黄油，搅拌均匀，得面团；
[0017]2)将所述面团静置松弛后，均匀分成小块，进行搓圆、整形、醒发，得面包坯；[0018]3)将所述面包坯放入烘烤箱内烘烤，将烘烤后面包冷却，得成品；
[0019]其中，步骤1)所述酸面团为含有上述述戊糖乳杆菌的酸面团。

[0020]优选，步骤1)中所述酸面团的具体制备步骤如下：
[0021]将上述的戊糖乳杆菌在无菌条件下接种于MRS液体培养基中，于37℃条件下活化两次后，以2％的接种量将活化后的戊糖乳杆菌接种到50mL的MRS液体培养基中，在37℃条件下，培养8h；
[0022]将面粉与无菌水按照质量比1：1混合后，将戊糖乳杆菌以108log cfu/g面粉的接种量接种，制作酸面团；
[0023]将所述酸面团置于醒发箱中醒发至pH＝3.7～4.1，备用。

[0024]进一步优选，将所述酸面团置于醒发箱中，在温度为30℃的条件下，醒发至pH＝3.7～4.1，备用。

[0025]进一步优选，步骤2)中所述醒发在温度为30℃，相对湿度为80％的条件下，醒发80min。

[0026]进一步优选，步骤3)中烘烤的条件为上下火180℃，烘烤20min。

[0027]本发明提供的戊糖乳杆菌，从酸汤子中提取获得，酸汤子，是纯天然玉米发酵食品，是集玉米深加工食品、特色发酵食品和益生功能性食品为一体的中国地方特色传统食品。

酸汤子中菌群丰富，开发价值较大。

对传统酸汤子进行乳酸菌分离及菌株鉴定，还未见报道；筛选出高产氨基酸的戊糖乳杆菌还未见报道。

利用Lactobacillus pentosus 124-2发酵小麦粉基质制成面包可填补特色乳酸菌开发现代酸面团发酵技术领域研究的空白，以期为工业化深度开发营养、健康、消费者喜爱的现代发酵食品提供现代技术。

[0028]本发明提供的发酵面包的制备方法中，通过在面粉中添加酵母菌和接种戊糖乳杆菌的酸面团，实现酵母菌与戊糖乳杆菌混菌发酵，从而提高面包中氨基酸含量，有利于促进面筋蛋白网络聚合体的形成，提高面筋的伸展性，使得最终制得的面包具有感官品质好、储藏稳定性高等优点。

[0029]应当理解的是，以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的，并不能限制本发明的公开。

附图说明
[0030]此处的附图被并入说明书中并构成本说明书的一部分，示出了符合本发明的实施例，并与说明书一起用于解释本发明的原理。

[0031]为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，对于本领域普通技术人员而言，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0032]图1为本发明公开实施例2中19株乳酸菌的琼脂糖凝胶电泳图；
[0033]图2为本发明公开实施例2中19株乳酸菌的系统发育树；
[0034]图3为本发明公开实施例3中面包芯的扫描图；
[0035]图4为本发明公开实施例5中面包的感官评定结果图；
[0036]图5为本发明公开实施例6中面包储藏期间的硬度变化图；
[0037]图6为本发明公开实施例7中面包储藏期间的热焓变化图。

具体实施方式
[0038]下面结合具体的实施方案对本发明进行进一步的解释，但是并不用于限制本发明的保护范围。

[0039]实施方案一
[0040]本实施方案提供了一种戊糖乳杆菌,该戊糖乳杆菌按照如下步骤提取获得：首先，将酸汤子用无菌生理盐水梯度稀释为1×10－4～1×10－7mol/l后，分别涂布于添加碳酸钙的固体培养基上，培养；然后，将固体培养基上菌落形态及溶钙圈不同的菌在MRS琼脂平板上重复划线分离,直至分离出纯种；最后，将分离的纯化菌进行革兰氏染色和接触酶试验，将革兰氏阳性且接触酶阴性的菌，通过分子生物学鉴定，获得戊糖乳杆菌。

[0041]上述实施方案中，首次提出了可在酸汤子中提取到戊糖乳杆菌，以酸汤子作为提取源，不仅提取方法简单，而且提取获得的戊糖乳杆菌活性高。

[0042]为了提高菌种培养的成活率，作为技术方案的改进，将涂布有酸汤子的固体培养基在温度为37℃的恒温条件下培养48-72h。

[0043]其中，按重量计，固体培养基上碳酸钙的含量为2％。

[0044]上述实施方案提供的戊糖乳杆菌可应用于发酵食品的制备中，下面以使用上述戊糖乳杆菌进行发酵面包制作为例，进行详细说明。

[0045]实施方案二
[0046]本实施方案提供了一种发酵面包的制备方法，该制备方法具体包括如下步骤：[0047]1)将面包粉、酸面团、绵白糖、食盐、酵母菌以及水，放入和面机中搅拌至成膜后，加入黄油，搅拌均匀，得面团；
[0048]2)将上述面团静置松弛后，均匀分成小块，进行搓圆、整形、醒发，得面包坯；[0049]3)将上述面包坯放入烘烤箱内烘烤，将烘烤后面包冷却，得成品；
[0050]其中，上述步骤1)中酸面团为含有采用上述实施方案中方法提取的戊糖乳杆菌的酸面团。

[0051]该酸面团的具体制备步骤如下：
[0052]将提取的戊糖乳杆菌在无菌条件下接种于MRS液体培养基中，于37℃条件下活化
两次后，以2％的接种量将活化后的戊糖乳杆菌接种到50mL的MRS液体培养基中，在37℃条件下，培养8h；
[0053]将面粉与无菌水按照质量比1：1混合后，将戊糖乳杆菌以108log cfu/g面粉的接种量接种，制作酸面团；
[0054]将该酸面团置于醒发箱中醒发至pH＝3.7～4.1，备用。

[0055]其中，面包粉、酸面团、绵白糖、食盐、酵母菌、水以及黄油的具体使用量，可以根据实际制备的面包种类进行确定，本实施方案不进行特殊限定。

[0056]为了提高酸面团的醒发效果和醒发速度，可将该酸面团置于醒发箱中，在温度为30℃的条件下，醒发至pH＝3.7～4.1，备用。

[0057]上述面包的制备方法中，在面粉内同时添加戊糖乳杆菌和酵母菌，进行混菌发酵，使得制备的发酵面包中富含半胱氨酸等发酵产物，半胱氨酸含量的提高有助于面筋蛋白间二硫键的形成及网络结构的建立，提高面包的感官品质和储藏稳定性。

此外，由于戊糖乳杆菌是从酸汤子中提取出来的，不产生毒素，安全性高。

[0058]为了进一步提高制备的发酵面包品质，作为技术方案的改进，将步骤2)中搓圆、整形的面团在温度为30℃，相对湿度为80％的条件下，醒发80min，以使面团充分醒发；将步骤3)中烘烤的条件设置为上下火180℃，烘烤20min。

[0059]下面结合具体的实施例对本发明进行更进一步的解释说明，但是并不用于限制本发明的保护范围。

[0060]实施例1
[0061]参照上述实施方案一提供的提取方法，从酸汤子样品中分离出19株菌，所有菌菌落形态均为乳白色、边缘光滑整齐、凸起的圆形菌落，除SB7外其他菌的生长状况良好，分离出菌菌落直径在0.8～1.3mm之间。

[0062]钙平板透明圈试验结果表明：SA4菌和SC样品分离出菌产生透明圈均较小，SB7菌产生的透明圈不明显。

分离菌都是革兰氏阳性，接触酶阴性菌，菌形态呈杆状，均为乳杆菌。

参见表1为19株微生物菌落形态及特性观察表。

[0063]表1：微生物菌落形态及特性观察
[0064]
[0065]
[0066]
[0067]注：G+表示革兰氏阳性；-表示接触酶阴性。

[0068]实施例2
[0069]将实施例1中分离的19株菌进行分子生物学鉴定，将从酸汤子中提取的19株乳酸菌的基因组DNA作为16S rDNA PCR扩增的模板，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳后通过凝胶成像仪照相观察，结果见图1(a、b)，1500bp处均出现明亮荧光条带，且无明显拖尾，表明PCR扩增成功，可满足后续测序要求。

[0070]将上述19株乳酸菌进行测序，并将测序结果在N C B I网站(h t t p:// )进行BLAST比对及同源性分析，结果见表2，其中，构建系统发育树如图2所示。

[0071]表2：19株乳酸菌16S rDNA序列Blast比对结果
[0072]
[0074]由表2和图2可知，上述19株菌均为乳杆菌，共有5个种，其中SA1、SA2、SA3、SA5、SA7、SB3、SB4、SB5为戊糖乳杆菌，SA4、SA8、SB1、SB2、SB6为植物乳杆菌，SC1、SC2为弯曲乳杆菌，SA6、SB7为短乳杆菌，SC3、SC4为副干酪乳杆菌。

[0075]实施例3
[0076]使用上述实施例分离获得的6株菌进行面包制备，具体如下：
[0077]1)乳酸菌面团制备
[0078]分别利用菌体浓度>108的Lactobacillus pentosus 124-2、Lactobacillus brevisATCC14869、Lactobacillus plantarum NBRC15891、Lactobacillus curvatus DSM20019、Lactobacillus paracaseiR094、Lactobacillus paracaseiNBRC15889与面粉、水混合，30℃培养。

[0079]2)乳酸菌、酵母菌混合面团制备
[0080]按照面粉120g、乳酸菌酸面团60g、绵白糖18g、食盐1.2g、酵母2.25g、水52.5g、黄油12g，30℃，相对湿度为80％醒发80min。

其他的制备过程参见实施方案二。

[0081]空白对照组：面制品用30g面粉和30g水取代乳酸菌酸面团。

[0082]其中，空白对照组(WBC)、加入戊糖乳杆菌的酸面团组(WBSA7)、加入短乳杆菌的酸面团组(WBSA6)、加入植物乳杆菌的酸面团组(WBSB1)、加入弯曲乳杆菌的酸面团组(WBSC2)以及加入副干酪乳杆菌的酸面团组(WBSC3、WBSC4)，将上述7组制备的面包进行游离氨基酸含量检测，具体见表3。

[0083]表3：酸汤子中6株乳酸菌发酵面包的游离氨基酸含量
[0085]由表3可见，与WBC相比，添加乳酸菌面团面包中谷氨酸、天冬氨酸两种氨基酸均不同程度降低，WBSA7、WBSB1、WBSC2三种面包游离氨基酸总量得到提高，其中WBSA 7提高了面包中半胱氨酸、组氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸含量。

[0086]实施例4
[0087]将实施例3中WBC、WBSA7、WBSB1以及WBSC2的面包进行pH、TTA、比容、高径比及烘焙损失检测，具体见表4。

[0088]表4：发酵面包的pH、TTA、比容、高径比及烘焙损失检测表
[0089]面包样品pH TTA比容(mL/g)高径比烘焙损失(％)
WBC 5.691±0.008a 3.450±0.050d 5.029±0.237b0.576±0.006a12.248±0.379a
WBSA7 4.607±0.022c 5.517±0.076a 5.451±0.099a0.523±0.003b11.731±0.279ab
WBSB1 4.913±0.010b 4.817±0.029b 4.944±0.065b0.565±0.011a11.031±0.339c
WBSC2 4.935±0.014b 4.467±0.115c 5.076±0.047b0.521±0.010b11.219±0.410bc [0090]注：不同的小写字母表示差异显著(p<0.05)。

[0091]由表4可见，酸面团的加入使面包的pH显著下降，TTA显著提高。

其中，添加SA7菌种的面包具有更低的pH和更高的TTA，其pH为4.607±0.022，TTA为5.517±0.076。

与WBC相比，WBSB1和WBSC2的比容无显著性差异，添加SA7菌种面包比容提高了8.391％。

[0092]实施例5
[0093]将实施例3中WBC、WBSA7、WBSB1以及WBSC2的面包进行质构特性的检测，具体见表5。

[0094]表5：发酵面包的质构特性表
[0095]面包样品硬度(g)胶着性(g)咀嚼性(mJ)弹性(mm)内聚性WBC233.333±11.251a199.333±25.469ab21.910±2.421a11.227±0.204a0.853±0.072
WBSA7212.833±4.252b176.367±21.169b16.197±1.886ab9.367±0.038b0.827±0.091
WBSB1239.167±12.741a208.667±13.844a20.087±0.640c9.857±0.956b0.863±0.035
WBSC2248.833±14.468a200.033±6.504ab18.193±2.665bc9.463±1.409b0.807±0.065 [0096]注：不同的小写字母表示差异显著(p<0.05)。

[0097]由表5可见，WBSB1、WBSC2的硬度、胶着性、咀嚼性无显著性差异，WBSA7的硬度、胶着性、咀嚼性显著性降低(P＜0.5)，对面包品质改善作用最大。

[0098]实施例6
[0099]将实施例3中WBC、WBSA7、WBSB1以及WBSC2的面包芯结构进行平板扫描，并进行灰白处理，具体见图3；同时将实施例3中WBC、WBSA7、WBSB1以及WBSC2的面包芯进行气孔的检测，具体见表6。

[0100]表6：发酵面包的面包芯气孔检测表
[0101]面包样品WBC WBSA7WBSB1WBSC2
CD(cells/cm2)70.333±4.04172.667±2.51770.333±2.51770.333±3.512
AF(％)49.919±0.577b54.709±1.690a49.625±0.577b51.589±3.946ab [0102]注：不同的小写字母表示差异显著(p<0.05)。

[0103]由图3和表6可见，与WBC相比，添加SA7的乳酸菌面团CD值提高较少，AF值提高了9.60％。

商业酵母产气速率较快，容易产生大而不均匀的气孔，乳酸菌发酵降低了酵母的产酸速率，面团的延展性得到提升，面包的孔洞更为均匀。

[0104]实施例7
[0105]将实施例3中WBC、WBSA7、WBSB1以及WBSC2的面包进行感官评定，具体见图4。

由图4可见，WBSA7面包的内部结构改善效果最佳。

[0106]实施例8
[0107]将实施例3中WBC、WBSA7、WBSB1以及WBSC2的面包在储藏期间进行硬度的变化情况检测，具体见图5。

由图5可见，随着储藏时间增加，所有面包硬度逐渐增加，储藏相同时间添加乳酸菌面团面包硬度显著低于WBC，不同乳酸菌面团对面包硬度的影响不同。

其中WBSA7和WBSC2在储藏期间的硬度无显著性差异，两种酸面包在储藏期间硬度均低于WBSB1。

[0108]实施例9
[0109]将实施例3中WBC、WBSA7、WBSB1以及WBSC2的面包在储藏期间对热焓变化进行检测，具体见图6。

由图6可见，随着储藏时间增加，所有面包老化焓值逐渐增加，储藏相同时间时添加乳酸菌面团面包老化焓值显著低于WBC，且不同乳酸菌面团对面包老化影响不同。

储藏1d时，WSC2老化焓值最低为0；储藏3，5，7d时，WBSA7面包老化焓值最低，WBSB1和WBSC2老化焓值稍高于WBSA7。

因此，WBSA7对改善面包老化现象作用最好。

[0110]本领域技术人员在考虑说明书及实践这里公开的发明后，将容易想到本发明的其它实施方案。

本申请旨在涵盖本发明的任何变型、用途或者适应性变化，这些变型、用途或者适应性变化遵循本发明的一般性原理并包括本发明未公开的本技术领域中的公知常识或惯用技术手段。

说明书和实施例仅被视为示例性的，本发明的真正范围和精神由下面的权利要求指出。

[0111]应当理解的是，本发明并不局限于上面已经描述的内容，并且可以在不脱离其范围进行各种修改和改变。

本发明的范围仅由所附的权利要求来限制。

图1
图2
图3
图4
图5
图6。