联合生物加工产纤维素乙醇中真菌的开发与应用

CHEMICAL INDUSTRY AND ENGINEERING PROGRESS 2018年第37卷第9期
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化 工 进
展
联合生物加工产纤维素乙醇中真菌的开发与应用
刘东国，吴云青，段学辉
（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，食品学院，江西 南昌 330047）
摘要：联合生物加工（consolidated bioprocessing ，CBP ）是在单一或组合微生物作用下，将纤维素酶生产、纤维素水解糖化、戊糖和己糖发酵产醇整合于单一步骤的生物加工过程。

本文从真菌在CBP 产纤维素乙醇中的开发历程着眼，回顾了纤维素乙醇产业化的发展进程，介绍了CBP 产纤维素乙醇的作用机理，系统总结了目前国内外文献中报道的CBP 底盘真菌的主要种类及优缺点，并综述了CBP 真菌的开发策略，包括工程化策略和共培养策略，着重阐述了工程化策略的技术路线和研究进展。

指出综合运用先进生物技术和基于代谢分析数据的计算机模拟系统开发CBP 目标微生物，设计新型高效的生物反应器以及将CBP 技术与现有生物工业整合，是未来将CBP 技术应用于纤维素乙醇产业的关键。

关键词：联合生物加工；真菌；发酵；纤维素乙醇；发展策略；产业化
中图分类号：TK6；Q81；X71；TQ92 文献标志码：A 文章编号：1000–6613（2018）09–3568–09 DOI ：10.16085/j.issn.1000-6613.2017-2139
Development and application of fungi in cellulosic ethanol prodution via
consolidated bioprocessing
LIU Dongguo, WU Yunqing, DUAN Xuehui
(State Key Laboratory of Food Science and Technology, School of Food Engineering, Nanchang University, Nanchang
330047, Jiangxi, China )
Abstract : Consolidated bioprocessing (CBP) is a biological process that combines cellulose production, cellulose hydrolysis saccharification, pentose and hexose fermentation into one step. CBP is influenced by the single microorganism or microbiome. This article focuses on the development course of fungi in cellulosic ethanol production using CBP. Meanwhile, it reviews the development process of cellulosic ethanol industrialization, and then introduces the function mechanism of cellulosic ethanol produced by CBP. In addition, this paper systematically summarizes the main types of the original fungi in CBP as reported in the literatures as well as their advantages and disadvantages. Moreover, it reviews the development strategies of fungi in CBP, including the engineering strategies and the co -culture strategies. Engineering strategies has been emphatically stated from the prespectives of the technological routes and the research progress. The article also points out that the combination of advanced biotechnology and computer simulation system based on metabolic analysis data to develop target microorganisms in CBP, the design of new and efficient bioreactors and the integration of CBP technology with the existing biotechnology, is the key for the future application of CBP technology in the cellulosic ethanol industry.
Key words : consolidated bioprocessing ；fungi ；fermentation ；cellulosic ethanol ；biological development strategy ；industrialization
E-mail ：*****************。

通讯作者：段学辉，教授，硕士生导
师，研究方向为绿色化工技术。

E-mail ：**************.cn 。

收稿日期：2017-10-19；修改稿日期：2017-11-27。

第一作者：刘东国（1993—），男，硕士研究生，研究方向为新能源技术。

第9期刘东国等：联合生物加工产纤维素乙醇中真菌的开发与应用·3569·
随着石油、天然气等不可再生能源日渐短缺，人们迫切寻求可持续能源来替代。

生物乙醇以其特有优势成为传统石油基运输燃料最有潜力的替代品之一[1]。

纤维素生物质是自然界中最丰富的碳源，因此以纤维素生物质为原料的二代生物乙醇研究受到了广泛重视。

木质纤维素主要由纤维素（25%～55%）、半纤维素（11%～50%）和木质素（10%～40%）组成[2]，结构复杂，难以被分解利用，是二代生物乙醇的主要技术障碍。

纤维素生物质转化为乙醇，包括生物质预处理、酶水解、戊糖和己糖发酵，生产成本过高。

目前纤维素乙醇生产工艺主要有4种[3]，其中联合生物加工（CBP）法生产纤维素乙醇操作简便，污染低，效率高，投入小，被广泛认为是降低纤维素乙醇生产成本最有效的可能策略[4]。

理想CBP系统的机理如图1所示[4]：在单个生物反应器中，CBP 微生物或共培养菌株分泌纤维素酶和半纤维素酶，将纤维素和半纤维素部分酶促水解成可发酵的己糖和戊糖，引入戊糖发酵途径后，将己糖和戊糖转化成乙醇。

寻求合适菌株，是应用CBP技术商业化生产纤维素乙醇的关键。

纤维素生物质可利用量由微
图1 CBP微生物在单一生物反应器中将木质纤维素转化成
生物乙醇的图解说明[4]生物产生的降解酶决定，真菌是该群体中优势菌种，其分解生物质类似自然降解过程。

迄今为止，CBP乙醇尚未达到一定程度的经济可行性，使其能够与石油基燃料竞争。

GUO等[5]研究了酿酒酵母（S. cerevisiae）DQ1使用螺旋带搅拌生物反应器在菊芋块茎高加载条件下发酵生产乙醇，产量达到128.7g/L。

结果表明，在螺旋带式生物反应器中开发CBP工艺技术的可行性很高。

RAFTERY等[6]试验了以甘蔗渣为原料，经氢氧化钠预处理和能量热电联产生产约6600万加仑乙醇的CBP设备，并进一步研究了该CBP工厂的经济性。

该研究显示了利用CBP技术生产商业规模纤维素乙醇的可行性。

目前，Mascoma公司是CBP乙醇生产的主要行业领导者，其利用细菌和酵母共同完成纤维素酶生产和乙醇发酵过程[7]。

未来，其与瓦莱罗合资的商业化纤维素乙醇工厂也将利用CBP技术[8]。

CBP技术在我国工业化生产纤维素乙醇中尚未有应用，今后，这方面的研究将越来越多，产业化进程也将逐步加快。

本文全面综述了CBP法生产纤维素乙醇中真菌的研究开发及发展策略，展望了真菌利用纤维素生物质生产CBP乙醇的前景。

1 CBP底盘微生物——野生型真菌
近年来，人们在利用木质纤维生物质生产CBP 乙醇的理论研究和实践应用方面均取得较大进步。

微生物通常仅能有效降解一种或几种纤维素中多糖，且对生物质预处理中可能存在的抑制剂表现出敏感性，因此目前尚没有一种微生物或一套酶系可按传统方法用于大规模降解或转化木质纤维生物质。

研究发现具有生产CBP乙醇潜力的真菌主要是丝状真菌、白腐真菌以及酵母菌，这些微生物在代谢木质纤维生物质时各有优势，转化能力差异较大[9]。

理想CBP生物体具有的特征包括[10]：①可分泌多种高活性纤维素分解酶；②代谢木质纤维素中存在的所有己糖和戊糖的能力；③乙醇产量高，效价高；④底物和产物等抑制剂耐受性高；⑤工业过程中的一般稳健性；⑥耐低pH和高温；⑦易于DNA操作；⑧高水平外源蛋白质表达；⑨GRAS状态；⑩连续过程中的产物可回收性；最低营养补充要求。

1.1 丝状真菌
1.1.1 木霉属（Trichoderma spp.）
木霉属中里氏木霉（T. reesei）作为颇具潜力的
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CBP候选菌株，因对其结构机理研究较为成熟且具有广泛的遗传操作工具而脱颖而出。

里氏木霉于木质纤维生物质有氧生长时产生纤维素酶将纤维素降解为糖；无氧时，则将所得糖发酵成乙醇，其具有将木质纤维素转化为生物乙醇的所有代谢途径[11]。

当然，里氏木霉用作CBP菌株仍有众多挑战，如乙醇产量低、耐受性差、发酵过程能量需求高等，且里氏木霉专性需氧的特性也将是其用于CBP乙醇生产的关键问题。

此外，木霉属中绿色木霉（T. viride）、康氏木霉（T. koningii）等也是出色的纤维素分解菌。

1.1.2 曲霉属（Aspergillus spp.）
迄今为止，已有多篇文献报道了曲霉菌工业生产纤维素酶，且证实大多数曲霉可将葡萄糖转化为乙醇[12]。

曲霉菌作为CBP菌株的主要局限性在于乙醇产量低，且会形成副产物乳酸盐。

HOSSAIN等[13]用米曲霉（A. oryzae）对连续搅拌分批生物反应器中的玉米秸秆进行直接生产乙醇的优化，当以稀碱性过氧化物预处理的玉米秸秆用作碳源时，得到了
0.819g/g的最大乙醇浓度。

1.1.3 镰孢属（Fusarium spp.）
早在20年前，镰孢属就被证明可直接将生物质转化为乙醇。

与其他真菌相比，其对底物和产物的耐受性相对较高。

其中尖孢镰刀菌（F. oxysporum）可产生多种纤维素酶，并将相应己糖和戊糖发酵成乙醇。

其底物选择范围广，水解和利用木质纤维素发酵乙醇的能力强，被认为是有希望的CBP菌株。

野生型菌株水解酶的多样性和生产水平与曲霉属和木霉属相似[14]。

XU等[15]通过添加咪唑离子液体（IL）来富集培养IL耐受性微生物得到的尖孢镰刀菌BN，可通过CBP直接将经IL处理的稻草转化为乙醇。

在最佳发酵条件35℃下发酵8天，得到最大乙醇产量0.125g/g，为理论产率的64.2%。

未来需更好地研究该真菌代谢途径及瓶颈。

此外，轮状镰刀霉菌（F. verticillioides）也已被证实是从木质纤维生物质直接生产乙醇的潜在CBP菌株[16]。

1.1.4 根霉属（Rhizopus spp.）
根霉属在CBP乙醇中研究相对较少。

与其他丝状真菌相比，根霉属基因组仅含极少数量的糖苷水解酶（GH）编码基因。

米根霉（R. oryzae）具有众多优点，如可发酵戊糖、生长要求低、对木质纤维素酸性水解产物中存在抑制剂的高耐受性等，成为CBP潜在候选菌株[17]。

米根霉被研究用于将玉米粉原料直接转化为乙醇，培养48h后获得乙醇体积分数为21%，乙醇转换率为理论值的94.5%[18]，但其生产时伴随显著量的副产物乳酸，可通过敲除相应基因改善。

1.1.5 毛霉属（Mucor spp.）
印度毛霉菌（M. indicus）可在多种纤维素底物上生长，分泌极少量纤维素分解酶。

高产乙醇是该菌株的重要特征。

INOKUMA等[19]研究并证实可利用卷枝毛霉（M. circinelloides）分解N-乙酰基葡萄糖胺（GlcNAc）或几丁质废物生产CBP乙醇。

然而，这些菌株中的几丁质分解活性较低，有必要优化发酵条件，表征单个几丁质分解酶，筛选几丁质酶用于添加等。

除此以外，冻土毛霉（M. hiemalis）利用纤维素生产CBP乙醇研究也越来越多[20]。

1.1.6 脉孢菌属（Neurospora spp.）
脉孢菌属产纤维素乙醇尚未得到广泛研究。

其中粗糙脉孢菌（N.crassa）被证实具有合成和分泌各种纤维素降解酶的能力，且该菌株可分解纤维素聚合物和农业、工业残留物并利用所得己糖和戊糖发酵乙醇[21]。

这些特征使粗糙脉孢菌（N.crassa）成为CBP乙醇生产的候选菌株，其主要限制因素是乙醇发酵速率慢，代时长。

WATERS等[22]研究了73种天然粗糙脉孢菌的纤维素分解和糖化发酵能力，发现部分菌株乙醇产率明显优于参考菌株，在F1种群N345中乙醇产量最低的菌株也提高了10%。

通过应用固定化细胞培养物，提高对水解产物的耐受性，可改善粗糙脉孢菌的发酵能力。

1.1.7 其他丝状真菌
除此以外，还有一些丝状真菌表现出了作为CBP菌株的潜力。

ZERV A等[23]利用一株自腐烂生物质中分离的天然宛式拟青霉（Paecilomyces variotii），以葡萄糖或木糖（20g/L）分别作碳源进行CBP实验，该菌株能够有效地将葡萄糖和木糖发酵成乙醇，且产率接近理论最大值，其中木糖转化浓度达到13.9g/L，是丝状真菌发酵戊糖产乙醇的最大值。

结果表明，宛式拟青霉（P. variotii）极具潜力应用于木质纤维素生产CBP乙醇。

最近，DE ALMEIDA等[16]的研究显示枝顶孢属菌（A. zeae）能够直接从木质纤维素生物质生产乙醇，有望应用于CBP乙醇。

1.2 酵母菌
酵母菌难以分解纤维素，因其较强的乙醇发酵能力，在CBP乙醇应用方面富有潜力。

1.2.1 酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）
酿酒酵母（S. cerevisiae）是利用己糖发酵乙醇
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最有效的生物之一，且表现出工业应用中多个有利特征，包括对低pH、高温和各种抑制剂的固有抗性，安全的GRAS状态，工业发酵的鲁棒性以及适用于遗传操作等，使其成为CBP的候选菌株[24]。

局限性在于不能分解纤维素、半纤维素，不能发酵戊糖。

该酵母属的遗传工程集中在与木糖运输和分解代谢有关基因的整合，或引入纤维素、半纤维素分解能力。

1.2.2 克鲁维酵母属（Kluyveromyces spp.）
与酿酒酵母（S. cerevisiae）相比，克鲁维酵母属被认为是更合适的CBP菌株。

它们可发酵己糖和戊糖，最佳发酵温度在40～45℃，更接近大多数商业纤维素酶和半纤维素酶的最佳活性温度，有利于应用在CBP系统中。

其中马克斯克鲁维酵母（K. marxianus）已被证明可在高于40℃下将碳水化合物发酵成乙醇，转化效率为85%～90%。

其具有安全的GRAS状态，分泌部分多糖水解酶能力，较高产物耐受性，是潜在的CBP候选菌种。

CHAROENSOPHARAT等[25]利用富集培养技术分离出一株马克斯克鲁维酵母DBKKU Y-102，以未水解处理的菊芋为原料通过CBP直接生产乙醇。

该菌株产生的最大乙醇浓度在37℃和40℃下分别为(104.83±0.53)g/L和(97.46±0.05) g/L。

1.2.3 毕赤酵母属（Pichia spp.）
毕赤酵母属可同时发酵己糖和戊糖，已被用于替代酿酒酵母生产乙醇的研究。

其中树干毕赤酵母（P. stipitis）可产生葡糖苷酶等多种纤维素分解酶，能利用葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木聚糖和纤维素等碳源生产乙醇。

据报道，该酵母可从木糖中产生超过60g/L乙醇，可像葡萄糖一样快速地发酵纤维二糖[26]。

缺点在于该酵母纤维素分解酶分泌量少，乙醇耐受性差、产率较低。

目前已经表征了树干毕赤酵母中木糖代谢和调控机制，实现了其全基因组测序[27]，以便更好地将树干毕赤酵母应用于CBP 乙醇研究。

1.2.4 多形汉逊酵母（Hansenula polymorpha）
多形汉逊酵母（H. polymorpha）能够将葡萄糖、木糖和纤维二糖发酵成乙醇，且具有乙醇耐受性强、抗重金属、抗氧化应激及高外源蛋白表达能力等优点，是有希望的CBP菌株。

其最佳生长温度为37℃，可在高达48℃下生长。

但该酵母生产外切纤维素酶能力较低，不能利用结晶纤维素，乙醇产量低于酿酒酵母，可通过经典选择和代谢工程得到改善。

RYABOV A等[28]利用从香樟中分离出的6株多形汉逊酵母使用立体培养物来研究其发酵木糖和其他碳源能力，最优菌株356利用木糖生产乙醇量可达3mg/mL。

1.2.5 其他酵母菌
除此之外，多种其他酵母由于自身特殊的性质和能力，也成为CBP的候选菌株。

最近，LIU等[29]分离和鉴定了一株棒孢酵母菌（Clavispora），具有使用纤维二糖作为唯一碳源的能力，并在SSF系统中生产足够量的β-葡萄糖苷酶用于纤维素乙醇生产。

TSUJI等[30]从南极分离出一株担子菌类嗜寒酵母Mrakia blollopis，低温条件下对各种糖具有独特的发酵能力。

该酵母可在10℃下利用添加有吐温80的纤维素生物质进行直接乙醇发酵。

管囊酵母（Pachysolen tannophilus）可利用D-木糖和木质纤维素发酵产乙醇。

另外，地丝菌属（Geotrichum）也显示出生产CBP乙醇的潜力[31]。

这些酵母作为CBP生物仍有较多挑战，比如不能合成和分泌高水平的纤维素分解酶，乙醇产量低于酿酒酵母等。

1.3 白腐真菌
担子菌能够分泌不同的木质素降解酶完全分解木质素，一些白腐真菌可产生醇脱氢酶，发酵己糖和戊糖生成乙醇。

因此，白腐真菌是潜在的CBP 菌株。

近几年，关于白腐真菌直接生产乙醇的研究越来越多[32]，为今后开发CBP菌株带来希望。

MA TTILA等[33]研究了使用射脉侧菌（Phlebioid radiata）多株白腐真菌以木质纤维素为底物生产CBP乙醇的实验，乙醇产量较高。

HORISAW A等[34]使用裂褶菌（Schizophyllum commune）NBRC 4928在厌氧条件单一反应器中进行多糖或木屑的乙醇生产。

研究表明裂褶菌NBRC 4928适用于CBP，其可以发酵各种类型的糖生成乙醇。

OKAMOTO等[35]评估了变色栓菌（T. versicolor）生产乙醇的CBP效率。

该菌株可以分别从20g/L淀粉、纤维素、木聚糖，麦麸和稻草中直接产生9.8g/L、4.7g/L、4.4g/L、5.0g/L 和4.8g/L乙醇。

结果表明，变色栓菌（T. versicolor）是潜在的CBP候选菌株，可将含己糖和木糖的木质纤维素生物质一步转化成乙醇。

毛柄金钱菌（Flammulina velutipes）能够将葡萄糖、甘露糖、蔗糖、果糖、麦芽糖和纤维二糖有效转化为乙醇[36]。

此外，毛栓菌（Trametes Hirsute）、灰隔孢伏革菌（Peniophora cinerea）、香栓菌（Trametes suaveolens）、黄孢原毛平革菌（Phanerochaete chrysosporium）也显示出从木质纤
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·3572·维生物质生产CBP 乙醇的潜力[37-39]。

但多数白腐真菌存在乙醇产量低，不耐受乙醇等缺点，使其难以实现在CBP 乙醇产业化的应用。

木质纤维生物质产乙醇的CBP 天然真菌汇总见表1。

2 CBP 菌株发展策略
CBP 菌株发展策略见图2。

研究表明，菌株“鲁棒性”地提升对增加CBP 乙醇产量有着较好的促进作用。

因此，“鲁棒性”底盘微生物的开发是改善CBP 乙醇生产的重中之重，基于此对CBP 候选菌株进行遗传工程操作或共培养以提升其产酶产醇能力，是目前主要的研究方向。

2.1 CBP 菌株工程化策略
实施CBP 菌株工程策略有两个主要途径：Ⅰ类基于天然生产纤维素酶的真菌，工程化使其能够发
酵糖；Ⅱ类旨在工程化可天然发酵乙醇的真菌，使其具有分解纤维素能力。

丝状真菌如木霉属、曲霉属、根霉属和镰孢属等已被鉴定为Ⅰ类CBP 候选菌株，而酵母菌是Ⅱ类中最具潜力的候选生物之一。

2.1.1 天然纤维素分解策略
Ⅰ类策略的主要研究目标是提高乙醇产量和对乙醇的耐受性，消除副产物，引入理想代谢途径，以利用大多数木质纤维素。

主要有以下几种技术手段：①筛选野生型菌株，随机或靶向诱变得到需求菌株；②引入外源基因；③敲除真菌中对应副产物合成基因；④工程化增加糖转运蛋白数量来提高同时利用戊糖和己糖的能力；⑤通过对乙醇耐受性基因和转录因子的识别和设计提高菌株乙醇耐受性。

HUANG 等[40]对一株野生型里氏木霉CICC 40360通过亚硝基胍（NTG
）处理孢子产生初始突
图2 CBP 菌株发展策略
表1 木质纤维生物质产乙醇的CBP 天然真菌微生物列表
底物
菌株 预处理
乙醇产量/产率
参考文献
玉米秸秆 米曲霉
稀碱性过氧化物预处理
0.819g/g [13]
稻草
尖孢镰刀菌BN IL 处理 0.125g/g ，理论产率的64.2%[15]GlcNAc 和几丁质底物 卷枝毛霉NBRC 8092
— 18.6g/L [19]芒草
粗糙脉孢菌 — 产量增加1倍
[22]
玉米芯或啤酒花粉 宛式拟青霉 —
1.2g/L [23]甘蔗渣 枝顶孢属菌
研磨、氢氧化钠预处理、固液分离等
3.9g/L [16]
菊芋 马克斯克鲁维酵母DBKKU Y-102
— (97.46±0.05)g/L [25]
玉米芯
棒孢酵母菌Y -50464 —
22.7g/L [29]
DEF 转换滤纸，日本雪松和桉树 Mrakia blollopis — 12.2g/L ，12.5g/L 和7.2g/L [30]废芯板 射脉侧菌0043 研磨均质化 5.9g/L ，产率10.4%
[33]麦麸和稻草
变色栓菌
— 5.0g/L 和4.8g/L
[35]
注：“—”表示未预处理。

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变菌群后，进行基因操作获得新的重组菌株HJ48，其乙醇产量是野生型的5倍以上，并可耐受4%（体积比）乙醇，显著改善里氏木霉的乙醇产量和乙醇耐受性，也使里氏木霉应用于木质纤维素产CBP乙醇更有前景。

WANG等[41]将一株白腐真菌Phanerochaete sordida YK-624中丙酮酸脱羧酶（PDC）基因经克隆后重新引入该菌得到转化体菌株GP7，以山毛榉木粉为碳源，GP7直接生产乙醇的产量比野生型YK-624高出1.41倍。

这些结果表明，通过重组PDC 的稳定表达可以提升菌株YK-624的乙醇产量。

MAEHARA等[42]将拟南芥中假定的木糖异构酶（XI）基因克隆并引入毛柄金钱菌中，假定基因成功表达，并且重组菌株中木糖的乙醇转化率增加。

该研究是通过基因工程设计毛柄金钱菌的第一份报告，显示出引入外源基因提升CBP乙醇产量的可行性。

ANASONTZIS等[43]从尖孢镰刀菌F3中分离出磷酸葡萄糖转运酶和醛酸酶相应的基因并构建表达载体组成重组尖孢镰刀菌FF11，以葡萄糖用作碳源时，FF11在厌氧发酵139h后产生超过20g/L的乙醇，产率高于F3，且FF11副产物乙酸盐产量更低。

在基因工程方面，除外源基因的表达应用外，科研人员也实现了同源基因的过表达。

ANASONTZIS等[44]通过尖孢镰刀菌中内切木聚糖酶2基因的过表达，使乙醇产量显著增加，提高了尖孢镰刀菌利用木质纤维素在CBP乙醇中的生产力。

利用Ⅰ类策略实现真菌在纤维素乙醇中的产业化应用，仍充满挑战。

2.1.2 重组纤维素分解策略
Ⅱ类策略的目标是实现菌株多种纤维素酶的表达和分泌，改善其在木质纤维生物质上生长、增殖及产还原糖能力等。

Ⅱ类中，关于酿酒酵母（S. cerevisiae）的研究最多，主要集中于以下几个方面：①戊糖发酵工程；②应用新的启动子增加酵母中纤维素酶基因的异源表达；③高拷贝数的纤维素酶基因；④酵母细胞表面展示技术。

ZHANG等[45]利用粗糙脉孢菌的木糖还原酶（XR）和毕赤酵母的木糖醇脱氢酶（XDH）构建了多株工程菌，各工程菌的木糖发酵能力得到显著改善。

其中工程菌株马克斯克鲁维酵母YZJ088从木糖中产生44.95g/L乙醇，实现了共发酵木糖和葡萄糖。

JO等[46]构建了重组酿酒酵母SX6MUT可表达木糖代谢酶以及醛脱氢酶，可将木糖转化为乙醇，产乙醇能力明显改善。

广泛的遗传操作工具使得代谢途径工程化更加可行。

其中，工业菌株中纤维素酶的异源表达将是改善CBP乙醇产量的有效方法。

TREEBUPACHATSAKUL等[47]将来自棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）AaBGL1的活性β-葡糖苷酶基因引入酿酒酵母，得到重组菌株乙醇产量增加至13.3g/L，72h SSF系统乙醇生产效率为54.6%。

AMOAH等[48]在酿酒酵母中异源表达5种纤维素酶基因（BGL，XYNⅡ，EGⅡ，CBHⅠ和CBHⅡ），利用得到的工程菌从离子液体预处理的甘蔗渣和Laubholz未漂白牛皮纸浆（LUKP）以CBP方式生产乙醇，较野生型产量明显提升。

TURANLI-YILDIZ等[49]通过体内进化工程策略选择经甲磺酸乙酯（EMS）诱变后的酿酒酵母克隆菌株，进化工程期间酵母菌群的二倍体化最高乙醇耐受达12%（体积分数），且对其他抑制剂具有交叉抗性。

KHATUN等[50]通过人造锌指蛋白（AZFP）库转化得到重组酿酒酵母，其耐热性提高，发酵时间缩短，乙醇产量提高。

这些结果提供了高温下从菊芋茎（JAS）和其他纤维素生物质基于CBP 生产高效乙醇的可行策略。

细胞表面展示酶的协同有助于生物量降解，KHATUN等[51]利用酿酒酵母MK01通过细胞表面展示来表达菊糖酶，利用CBP 在较高温度下以菊芋块茎为底物发酵乙醇。

其促进了菊糖的酶水解，乙醇产量也得到改善，达到85.2g/L。

另一方面，节省了冷却和运行设施的成本投入。

因此，通过细胞表面展示增强纤维素分解酶的表达，应用于CBP乙醇生产将富有希望。

最近，多基因的共表达研究也有所进展。

PUSEENAM等[52]开发了新型整合质粒，并转移至树干毕赤酵母实现了内切木聚糖酶和内切葡聚糖酶的共表达。

该工程菌可在以木聚糖和β-葡聚糖为碳源的培养基中生长，并以2.7g/L的产率直接生产乙醇，也可利用预处理的玉米芯为碳源直接生产乙醇。

2.2 CBP菌株共培养策略
通过微生物联盟生产纤维素乙醇是非常有希望的方法[53]。

一些生物过程是单一微生物不能完成或只能微弱地进行，而不同的纤维素分解菌与木质素分解菌对秸秆的联合分解能力明显高于任何单一菌株[54]。

因此，最近为CBP提出的新策略是菌株共培养，其菌株通常具有在自然界分解纤维素或发酵产乙醇的能力。

共生培养是组合代谢能力的手段，可经济有效地从木质纤维素生产生物乙醇。

将微生物联合体成功应用于CBP乙醇，需建立
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具有必要功能、过程控制和高效率的稳定共培养系统。

HO等[55]开发了一种用于纤维素生物乙醇生产的新型双微生物芽孢杆菌/酵母共培养体系。

其中，重组枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）和马克斯克鲁维酵母KY3-NpaBGS的纤维素糖化和乙醇生成结果最佳，乙醇转化率达到理论值的93.1%。

该研究结果表明，双微生物芽孢杆菌/酵母菌共培养系统可以利用两种微生物的不同优势，具有良好的CBP潜力。

ZUROFF等[56]研究并证明了Clostridium phytofermentans和酿酒酵母cdt-1之间的共生关系，两菌株的共培养物利用100g/L α-纤维素产生了约22g/L乙醇。

BRETHAUER等[57]通过对里氏木霉，酿酒酵母和树干毕赤酵母的共培养，从全浆稀释预处理小麦秸秆中生产乙醇，产率为67%。

该研究成功证明了微生物联合体利用木质纤维素生物质生产乙醇和化学品的可行性。

WILKINSON等[58]研究了多种真菌共培养并基于CBP从啤酒糟（BSG）中生产乙醇，其中米曲霉和酿酒酵母NCYC479在10天内产生乙醇最高浓度为37g/L。

该研究中也显示出CBP乙醇的明显缺点是产率较低，值得进一步探索和优化。

木质纤维素产乙醇的CBP菌株工程策略及微生物汇总见表2。

3 结语与展望
纤维素乙醇是世界性难题，研发进展也低于预期，CBP系统研究为纤维素乙醇带来了新的思路和方向。

在过去几年中，利用天然真菌产纤维素酶和发酵乙醇的方法，在开发CBP生物体方面取得了显著进展，这项工作也将一直持续。

新的生物技术，如宏基因组学、转录组学、间质转运蛋白、蛋白质组学、二代测序、合成生物学和代谢组学，为加快CBP乙醇商业化生产开辟了新的大门。

针对CBP乙醇的商业化应用存在的问题，未来的发展方向主要集中在以下几个方面。

（1）进一步设计用于联合纤维素分解和发酵乙醇的CBP重组菌株，使用先进的基因编辑技术开发定制的CBP微生物。

借助基于代谢分析数据的计算机模拟来设计优化代谢系统，表征代谢和调控机制，使用先进的工程工具对细胞内代谢途径进行系统范围的修改，将纤维素分解与发酵乙醇的代谢系统进行整合，增强细胞活力，提升多种纤维素和半纤维素分解酶的分泌和活力，拓宽底物可利用范围，可同时发酵戊糖和己糖，缩短发酵代时，通过研究产物、副产物等可能的抑制剂来增强产物耐受性，敲除副产物相关基因、过表达产物基因，提高乙醇产量。

未来，还需要对CBP系统生产乙醇进行技术和经济性分析，探索其产业化的可行性。

（2）目前，第二代生物燃料工业普遍存在高成本劣势，通过一代和二代生物乙醇技术过程的整合可能是将第二代生物燃料推向市场的最有效途径。

在现有行业，如糖和造纸工业中，仅使用部分生物质，导致剩余大量残留物，多适用于生产纤维素乙醇。

下一步将现有生物工业与CBP纤维素乙醇生产相结合，实现节省原料运输和处理成本以及能源消耗的整合，以最小化资本投入，改善总体经济效益。

（3）CBP乙醇的商业化应用值得相关研究人员
表2 木质纤维生物质产乙醇的CBP菌株工程策略及系统微生物
策略底物菌株预处理乙醇产量/产率参考文献
Ⅰ类甘蔗渣里氏木霉CICC 40360 研磨(9.7±0.2)g/L [40]
葡萄糖尖孢镰刀菌F3 —20g/L [43] 玉米芯，麦麸尖孢镰刀菌F3 研磨 2.85g/L，8.83g/L [44]
山毛榉木粉Phanerochaete sordida YK-624 —7.42% [41]
Ⅱ类北美脂松水解物酿酒酵母SX6MUT 研磨、硫酸处理、过滤、氢
氧化钙处理等
0.39g/g [46]
日本雪松酿酒酵母INVSc1 研磨13.3g/L [47] 甘蔗渣和LUKP 酿酒酵母MT8-1 离子液体预处理 0.93g/L和0.71g/L [48] 菊芋块茎酿酒酵母MK01 研磨89.3g/L [51]
玉米芯树干毕赤酵母BCC15191 氢氧化钠热处理0.38g/L [52] 共培养狼尾草芽孢杆菌和酵母干燥、切碎提升31%（37℃）和
58%（42℃）
[55]
α-纤维素Clostridium phytofermentans和酿酒酵母cdt-1—22g/L [56]
小麦秸秆里氏木霉，酿酒酵母和树干毕赤酵母全浆稀释67% [57] 啤酒糟（BSG）米曲霉和酿酒酵母NCYC479 干燥、研磨37g/L [58] 注：“—”表示未预处理。