免疫学检测方法培训课件

疫组织化学技术和荧光测定技术。荧光抗体
技术属于前者，它是利用某些荧光素通过化
学方法与特异性抗体结合，形成的免疫复合
物在一定波长光的激发下可产生荧光，因此
借助荧光显微镜检测或定位被检抗原。其又
可分为直接荧光抗体法、间接荧光抗体法和
补体荧光抗体法免疫。学检测方法
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荧光色素
异硫氰酸荧光素（FITC） 四乙基罗丹明（RB200） 四甲基异硫氰酸罗丹明（TMRITC)
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1、荧光抗体染色方法
直接法
间接法
2、荧光抗体技术的应用 在细菌学诊断中的应用 在病毒感染诊断中的应用 其它方面的应用
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间接荧光抗体法（IFAT）操作步骤如下：
（1）单层血细胞滴片，室温晾干，放入丙酮中固定10min。
室温晾干。
（2）以小白鼠抗血清（或杂交瘤细胞上清液）为第一抗体
应用：（1）基因组DNA分析； （2）遗传物质的鉴定； （3）遗传病的诊断。
缺点：（1）需靶DNA序列的信息； （2）产物短小，DNA复制不精确。
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原位杂交技术
是一种能够从形态学上证明特异性的DNA和 RNA存在于制备的个别细胞，组织部分，单 细胞或染色体中的技术。
原理是含有互补序列（探针）的被标记的单 链DNA或RNA片段在适当的条件下与细胞 的DNA或RNA杂交形成稳定的杂交体。
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免疫金标层析法的应用与研究进展
免疫金层析法快速诊断试纸条是20世纪90年代以来在单克隆抗体技术、胶 体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一项新型体外诊断技术
医学：乙肝表面抗原、心肌肌钙蛋白T 、 HCG
兽医：猪瘟抗体 食品：克伦特罗（瘦肉精）、氯霉素 其他：饲料中的磺胺类药物残留物、转基因产品
及实验室诊断提供了一项其它方法尚不能取代的
、并有其独特风格的技术。目前，该技术已广泛
应用于细菌、病毒、原虫以及真菌等的鉴定和相
应病的诊断，血清抗体的检查，病理组织学抗原
、抗体和补体的鉴定及定位，免疫复合物病理的
研究，细菌、病毒与细胞之间抗原关系的研究等
方面。其主要优点在于：特异性强，速度快，敏
感性高；其缺点在于：非特异性染色问题尚未解
。 （2）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （3）加AP-IgG 为第二抗体，37℃湿盒中孵育45min。 （4）0.01M PBS洗三次，每次5min。 （5）加NBT/BCIP底物缓冲液发色10min， （6）出现颜色加终止液终止反应。 （7）用酶标分析仪在405nm,处测定各孔的吸光度，计算P／N（样品光吸收值
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直接法检测抗原
NCM病毒---金标单抗显色
DIGFA步骤简化、时间缩短。
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❖ DIGFA检测操作程序
a. 2µl检测样品-----NCM----直径2mm点-----晾干；
100µl封闭液，渗入；
100µl的金标抗体，渗入；
e. 100µl 的0.01M PBS-T（含0.05%Tween-20）， 渗入；
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检测技术种类
一、免疫学检测
免疫凝集试验 免疫沉淀试验 酶联免疫试验 荧光免疫技术 免疫电镜技术 免疫印迹试验
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细菌凝集反应被广泛应用于细菌学的诊断。在凝集反应 中，将参与反应的抗原称为凝集原，抗体称为凝集素。
凝集法测定哈维氏弧菌抗体的效价
➢ 铁蛋白抗体法 ➢ 酶标记抗体法 ➢ 重金属标记抗体法
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图 胶体金标记免疫电镜结免果疫学[检(A测)方(法D) bar = 200 nm; (B)
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(C) bar = 100 nm]
胶体金免疫技术
胶体金是氯金酸在还原剂如白磷、抗坏血酸 等作用下的水溶液，具有高电子密度，并能 与多种大分子发生物理吸附，因此，不但所 有的大分子物质都可被金标记，而且标记后 大分子物质活性不发生改变。
3) 反应程序：
变性 ( 94~95oC)
复性
延伸
( 37~55 oC)
( 70~72 oC )
72 oC延伸10min
30-35cycles DNA扩增100万倍
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PCR扩增
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PCR特点及应用：
优点：（1）特异性强、灵敏度高、稳定可靠、快速； （2）微量的模板DNA即可扩增大量产物。
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免疫电镜技术
免疫电镜技术（immune electron microscopic technique） 是一种将免疫学技术与电子显微镜技术相结合的血清学方 法，能使抗原在分子水平上进行定位。它实际上是将细胞 水平的荧光抗体技术的基本原理应用于分子水平上。这一 技术的发明使抗原和抗体的定位研究达到了亚细胞或分子 水平。主要有以下几种技术。
检测结果：红色斑点的为阳性，无红色斑点的为阴 性。
阳性免疫代学检表测方检法 测样品中有病毒，阴性47
DIGFA检测结果, 红色斑点的为病毒阳性,无红色斑点的为病毒阴性。
The result of DIGFA, red dot shows there is WSSV, otherwise, there is no WSSV.
决，结果判定的客观性不足，技术程序也比较复
杂。
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1、原理
荧光免疫技术是一种以荧光物质作为标记
物的免疫分析技术，荧光物质的分子在特定
条件下吸收激发光的能量后，分子呈激发态
而极不稳定，其迅速回到基态时，以电磁辐
射形式释放出所有的光能，发射出波长较照
射光长的荧光。荧光免疫技术可分为荧光免
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四、Western blot
是蛋白水平检测，研究基因表达与功能的一种方法 。
原理及步骤
样品
聚丙烯酰胺凝胶电泳，分离蛋白 （SDS-PAGE )
转移（印迹）于硝酸纤维素膜
加抗体检测某种特异性蛋白质
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West Blot
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图：淋巴囊肿病毒与抗血清的Western blotting结果
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检测试纸的原理是：采用夹心免疫层析原理，即由 金标单抗同检测样品液中的抗原反应，形成由金标 单抗-抗原复合物，当该复合物层析至硝酸纤维素 膜上预先包被在检测线上的另一种单抗处时，此处 的抗体会识别该复合物中抗原，反应的结果便形成 了金标单抗+抗原+包被单抗的夹心结构，最终是 金标单抗上的胶体金颗粒在此固定并累积出现肉眼 可见的红色线，未反应的金标单抗则仍继续层析前 行,当到达点预先包被在质控线羊抗鼠抗体处时，金 标单抗被其结合住，从而在此处也出现由胶体金颗 粒固定并累积而显现出肉眼可见的红色线，结果是 ：检测线显示红色表示样品阳性；检测线不显示红 色，表示样品阴性。质控线显示红色，表示试纸有 效；质控线处不显示红色，说明试纸失效，即或是 金标单抗、或是羊抗免疫鼠学检抗测方法体失活，检测结果无效50 。
TTGCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGAGCTGCTACGTAA
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原 理：
1) 合成待扩增区域两端已知序列，与模板DNA互 补的寡核苷酸特异性引物，引物的序列决定扩增 片段的长度；
2) 反应体系：DNA模板，dNTP，Taq DNA聚 合酶，buffer
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间接标记：将半抗原（如生物素或地高辛） 附着于探针上，然后用标记的结合蛋白（如 亲和素）检测或者用特异性的抗体检测靶探 针杂交体。
直接化学发光的机理
--- 夹心法
+ + 磁微粒 抗体
被测抗原
带丫啶酯 标记物抗
体
（1） 加入H2O2 （pH<10）
（2） 加入碱 （pH>10）
发光
冲洗后
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磁微粒技术
Y
磁微粒模式图
特点 – 已结合的抗原和抗体与 未结合部分的易分离
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五、聚合酶链反应（polymerase chain reaction,PCR）
，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育45min。
（3）0.01M PBS洗三次，每次5min。
（4）加第二抗体IgG-FITC ，37℃湿盒中孵育45min。
（5）0.01M PBS洗三次，每次5min。
（6）甘油封片，荧光镜下观察，拍照。
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间接免疫荧光法检测对虾白斑症病毒病
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Taq Polymerase
GCATCATCGTATCGTTACATGTAGTAGTCTATCTGCTAACTGTCACTAGA
GCTGCTACGTAG
CGTAGTAGCA TAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC
Taq Polymerase
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间接免疫荧光法检测淋巴囊肿病毒
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免疫学检测方法
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直接ELISA 免疫学检测方法
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间接ELISA 免疫学检测方法
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间接酶联免疫吸附试验
操作步骤如下： （1）分别以不同单抗为第一抗体，加在血细胞抗原上。37℃湿盒中孵育60min
1.稀释抗体
管号 磷酸盐缓冲液
1
2
3
4
5
6
7
0.9 0.9
0.9
0.9
0.9
0.9
1.0
兔抗X菌血清
0.1 0.1(1 0.1(
)
2)
0.1( 3)
0.1( 4)
0.1(5 0.0 )
2.玻片凝集法
A.用1ml移液枪取6号离心管中的溶液一滴滴在载玻片的一端，另一端加一滴
磷酸盐缓冲液，然后分别加一滴准备好的X菌液。
与阴性对照的值），判定ELISA反应结果。大于2.1时可判断为阳性。 以最大显色至阳性的显色孔50%反应孔的抗体稀释倍数为抗体效价。
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免疫学检测方法
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图 DOT BLOT方法筛选结果图。
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免疫组织化学方法定扇贝血细胞分布
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细胞免疫化学法检测病毒感染
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免疫学检测方法
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免疫学检测方法
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双向免疫扩散沉淀线示意图
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琼扩反应
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免疫学检测方法
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中和实验
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荧光免疫技术
荧光免疫技术又称荧光抗体技术。它将免疫
化学和血清学的高度特异性和敏感性与显微技术
的高度精确性相结合，为免疫学、临床组织化学
该试纸条构成:载体板7；在该载体板7的两端部，分别设有加样端4吸水层和 手持端1吸水层；在该载体板7中部段设有硝酸纤维膜的检测层2，在该检测 层2与加样端4吸水层交界处，设有载有金标单抗E的玻璃纤维层块3，该层块 3一端部分设置在加样端4吸水层之下，其另一端部分设置在检测层2之上； 在与该层块3延续的检测层2免上疫学设检有测方检法测线6和质控线5，该检测线6和5质1 控线 5处分别包被有抗病毒单抗和羊抗鼠IgG。
B.牙签混匀，至于显微镜下观察，看是否有凝集块的形成。
C.后取5、4……1号管的溶液逐个重复1、2步骤。
D.取有凝集块变为无凝集块时,那个有凝集反应的试管作为抗体的效价。
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免疫学检测方法
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免疫学检测方法
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免疫学检测方法
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沉淀凝集反应 免疫学检测方法
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免疫学检测方法
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免疫学检测方法
免疫学：
NCM为固相载体-----通过渗滤----抗原与抗 体在膜上快速反应-----标记的胶体金堆积显 色。
胶体金
吸水垫
抗原
抗体
NCM
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临床应用： ❖ 间接法测抗体：
NCM 抗原----样品抗体----金标抗抗体显
色
❖ 夹心法测抗原：
NCM多抗----样品抗原----金标单抗显色。
PCR是模拟体内DNA复制 条件，应用DNA聚合酶反 应，特异性扩增某一DNA 片段的技术。体外程序化 的DNA合成技术。
Kary B. Mullis 免疫学检测方法
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免疫学检测方法
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PCR
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Step3 : Extension 延伸 72°C
ACGTAGTAGCATAGCAATGTACATCATCAGATAGACGATTGACAGTGATCTCGACGATGCATC
当抗原和金标抗体反应时，肉眼可见红色或 粉红色斑条（点）,在显微镜下观察，抗原 抗体结合处为黑褐色的颗粒。
免疫学检测方法
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斑点免疫金渗滤法（DIGFA）的应用 与研究进展
是20世纪八十年代发展起来的一种免疫学检 测方法，具有简便、快速、准确等优点。目前在 医学检验中主要应用于检测 HBsAg、HCG 和 HIV等。