菊叶总黄酮抗肿瘤作用初步研究

安徽菊花道地药材有“亳菊”、“滁菊”、“贡菊”
三种,具有清热明目之效[1].菊叶为植物菊花的茎上叶,有治疗疮、痈疽、头风、目眩的功效[2],菊叶提取物有抗菌、保护心肌缺血、抗氧化的作用.菊叶中主要含有黄酮类、挥发油、绿原酸三种成分[3].
国内研究表明,黄酮类化合物已成为新的抗肿
瘤研究热点,目前已发现多种植物提取物中黄酮类成分有抗肿瘤活性,如鸡血藤黄酮类成分可抑制乳腺癌细胞生长[4],木瓜总黄酮对死亡因子(P D )-1与其配体(PD-L1)的结合有抑制作用,使肿瘤细胞表面PD-L1的表达降低而促进机体对肿瘤的免疫应答,达到抑制肿瘤细胞生长的作用[5].万寿菊茎叶中两种黄酮类化合物4'-甲氧基-泽兰素3-O-β-D-葡萄糖苷和山柰酚-3,7-O-α-L-双鼠李糖苷均可抑制人胃癌细胞S GC7901和人肝癌细胞S MMC7721的增殖,且呈现浓度与时间依赖性[6].黄明玉等[7]研究山茶花总黄酮抑制小鼠H22肝癌移植瘤生长,结果显示,总黄酮高、中剂量组可明显降低瘤体重量,显著增加小鼠脾和胸腺指数,显著提高巨噬细胞吞噬功能和淋巴细胞转化能力.本论文拟对菊叶中总黄酮的抗肿瘤作用进行初步研究,以期为其开发应用奠定一定的理论基础.1材料与方法1.1材料
1.1.1试剂与药品
菊叶,来自安徽滁州地区;瘤株S 180,由中国医学科学院肿瘤细胞库提供;MTT (噻唑蓝)、环磷酰胺,购于美国S igma 公司;其它试剂均为分析纯.1.1.2实验动物
清洁级雄性小鼠,体质量18-22g ,由安徽医科大学动物实验中心提供,合格证号:皖医实动准字01号.
1.1.3仪器与设备
S AFEDA MB-601型全自动酶标仪,北京赛必达科技有限公司;UV-4802S 型紫外可见分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司;CHP 型CO 2培养箱,常州普天仪器制造有限公司;Leica XDS -200倒置显微镜,上海蔡康光学仪器有限公司.1.2方法
1.2.1菊叶总黄酮的提取[8]
称取菊叶粗粉20g ,加入50%乙醇600m l 回流提取时间3次(2h ,1h ,0.5h ),抽滤,提取液浓缩至小体积,加水和石油醚萃取3次,将水液浓缩,备用.
1.2.2菊叶总黄酮的纯化[9]
称取8g 经预处理的X-5型大孔树脂,用水溶液装柱(2.5cm ×30cm ).量取供试液3m L 加入相同量的聚酰胺,水浴蒸干后置于前面树脂柱中,水洗至无色.再以70%乙醇洗脱至125m L.提取液量(mL )与聚酰胺量(g )比例为1.5:1,树脂(g)-提取液
Vol.30No.10Oct.2014
赤峰学院学报(自然科学版)
Journal of Chifeng University (Natural S cience Edition )第30卷第10期(下)
2014年10月菊叶总黄酮抗肿瘤作用初步研究
卫
强,徐
飞,邱
镇,纪小影
(安徽新华学院
药学院,安徽
合肥
230088)
摘
要:本文以MTT 法考察菊叶中总黄酮的体外抗肿瘤活性;以小鼠移植瘤模型测定总黄酮对荷瘤
小鼠抑瘤率和腹腔巨噬细胞吞噬能力,研究其体内抗肿瘤活性和免疫调节作用.结果表明,总黄酮对S180细胞生长有显著抑制作用.体内试验表明,与生理盐水组相比,总黄酮对小鼠S180实体瘤有显著抑制作用(P 约0.01),抑瘤同时可促进体重增长;总黄酮高剂量组可提高荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数.与环磷酰胺组和生理盐水组比较,总黄酮可使荷S180实体瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力升高,表明其对小鼠没有免疫抑制作用.
关键词:菊叶;总黄酮;抗肿瘤中图分类号:R285;R979.1
文献标识码:A
文章编号:1673-260X (2014)10-0072-03
基金项目:安徽省高等学校省级自然科学研究项目(KJ2013B103);国家大学生创新创业训练项目(201312216028,201312216029);安徽省大学生创新创业训练项目(AH201312216001);安徽省质量工程项目(2013gxk105);安徽新华学院质量工程项目(2013gxkcx01)72--
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(m L)为4:3,色谱柱径高比1:20,洗脱液收集量为2BV ,得总黄酮(纯度80.1%).1.2.3瘤细胞悬液制备
选择接种后8d 健康的S 180种鼠,颈椎脱臼,固定于蜡板上,腹部皮肤消毒后,剪开并剥去腹部皮肤,用空针穿过腹部肌肉,无菌获取的腹水,以生理盐水稀释成肿瘤细胞悬液(浓度106个/mL ).1.2.4抗肿瘤试验(MTT 法)
将1.2.1项下S 180细胞悬液接种于96孔板,保持每孔100μL.设菊叶总黄酮组、空白组、阴性对照组三个组别,每组6个复孔.接种后,在5%CO 2饱和湿度孵箱内和37℃下培养,过夜,贴壁或离心后,对照组换液、药物组加入20、40、100、200、500m g /L 的总黄酮培养液各60μL ,培养48h 后以MTT 法检测细胞活力[10-11].每孔加入MTT 液(3g/L )8μL ,3h 后,吸取培养液,加入120μL 二甲基亚砜,在波长490nm 处以酶标仪测定吸光度(A ),计算细胞生长的抑制率.
1.2.5对小鼠S 180实体瘤生长和免疫器官的影响
选取60只ICR 小鼠作为试验动物,将含106个/m L 的S 180细胞悬液接种到小鼠右前肢腋窝下,0.3m L/只.24h 后,将小鼠随机分成生理盐水组、环磷酰胺组(22m g /kg )、菊叶总黄酮高、中、低三个剂量组(500、300、100m g /kg ),共5组,每组12只.次
日开始接种,隔日腹腔注射环磷酰胺,每日连续灌
胃给予总黄酮.每日记录小鼠体重,观察并记录小鼠死亡时间.14d 后脱颈椎处死小鼠,根据瘤块计算抑瘤率,根据胸腺和脾脏计算脏器指数[12].
1.2.6对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响
动物分组及给药方法同“ 1.2.3”.小鼠处死后腹腔注射RPMI 1640培养液约3m L ,收集腹腔液,离心2m in (2500r/m in ),弃去上清液,以培养液调到每升含2×109个细胞.将巨噬细胞悬液接种于96孔板,保持每孔100μL ,置5%CO 2培养箱和37℃下培养4h ,除去上清液,每孔加入50μL 0.2%中性红溶液,培养30m in.取出培养板,以磷酸盐缓冲液数次冲洗,每孔加入100μL 细胞裂解液,于570nm 处进行可见-紫外分光光度计测定吸收度值[13-14].1.2.7统计和分析
采用Cochran &Cox 近似t 检验.2结果与分析
2.1体外对肿瘤细胞存活的抑制作用
如图1所示,菊叶总黄酮质量浓度与S 180细胞存活的抑制有相关性,在浓度高于200m g /L 时,对S 180细胞抑制作用明显;在600mg/L 时最高,抑制率为82.2%.
2.2对S 180荷瘤小鼠的影响
结果见表1和表
2.
图1菊叶总黄酮对S 180细胞的抑制作用
组别剂量(mg/kg )
体重增加量(g )瘤重(g )抑瘤率
生理盐水组15.71±2.09 1.99±0.21△△环磷酰胺组2015.01±3.080.92±0.26b 53.77总黄酮低剂量组10016.92±2.76 1.34±0.25b △△32.66总黄酮中剂量组30018.22±3.03a △ 1.21±0.36b △39.20总黄酮高剂量组
50018.65±2.71a △
1.05±0.37b
47.23表1菊叶总黄酮对S 180荷瘤小鼠体重和抑瘤率的影响(n=12,x ±S D )
注:与生理盐水组相比,a P<0.05,b P<0.01;与环磷酰胺组比较,△P<0.05,△△P<0.01由表1可知,与生理盐水组相比,不同剂量的菊叶总黄酮均可显著抑制S 180实体瘤的生长(P ＜0.01),有剂量相关性;菊叶总黄酮高剂量组抑瘤率达到47.23%,略低于环磷酰胺对照组.总黄酮低剂量组与环磷酰胺组抑瘤率比较有显著性差异(P ＜0.01).总黄酮高、中、低剂量组在促进小鼠体重增长上与生理盐水组、环磷酰胺组相比均显示较显著性差异(P ＜0.05).由表2可知,环磷酰胺可明显抑制S 180实体瘤的生长,但对提高小鼠免疫器官的免疫功能能力不显著.与环磷酰胺组比较,菊叶总黄酮高剂量组可使小鼠的脾指数和胸腺指数较显著
组别剂量(mg/kg )
脾指数(mg/g )胸腺指数(mg/g )生理盐水组 4.26±0.56 1.32±0.36环磷酰胺组20 4.31±0.72 1.44±0.38总黄酮低剂量组100 5.12±0.83a △ 1.52±0.29总黄酮中剂量组300 5.46±0.91b △△ 1.61±0.37
总黄酮高剂量组
500 5.71±0.68b △△
1.70±0.42a 表2
菊叶总黄酮对S 180荷瘤小鼠免疫器官的影响
(n=12,x ±S D )注:与生理盐水组相比,a P<0.05,b P<0.01;与环磷酰胺组比较,△P<0.05,△△P<0.01
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组别剂量(mg/kg )
吸光值生理盐水组0.438±0.057环磷酰胺组200.412±0.078总黄酮低剂量组1000.546±0.034b △△总黄酮中剂量组3000.592±0.059b △△总黄酮高剂量组
5000.613±0.066b △△
注:与生理盐水组相比,b P<0.01;与环磷酰胺组相比,△△P<0.01
表3
菊叶总黄酮对小鼠巨噬细胞吞噬能力的影响(n=12,x ±S D )的增加(P ＜0.05),表明其在抑瘤与增强荷瘤小鼠免疫功能方面有一定相关性.
2.3对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力的影响
结果见表3.
由表3可知,与生理盐水组相比,环磷酰胺组可使小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力降低5.94%,表明其对S 180实体瘤小鼠免疫功能有明显抑制作用.与生理盐水组相比,菊叶总黄酮高、中、低剂量组可使腹腔巨噬细胞吞噬能力显著升高(P ＜0.01),分别增加39.95%、35.16%和24.66%.3结论与讨论
菊叶资源蕴藏量丰富,据统计,贡菊和杭菊每年有5000吨左右[15]的产量.从产量上来说,菊叶比菊花大得多.由于菊叶不能直接作为药用,菊花被
采集时,菊叶被大量废弃.根据对滁菊花提取工艺
研究结果,滁菊花中总黄酮的平均含量为6.70％[16]
,滁菊叶中总黄酮的平均含量为10.06％[8].可见,菊叶中黄酮成分相对菊花有明显的含量优势,有较高的开发利用价值.
本实验以MTT 法证明菊叶总黄酮对S 180细胞生长有显著抑制作用,在质量浓度达到600m g /L 时最高,抑制率为82.2%.实验建立了小鼠移植瘤模型,通过测定菊叶总黄酮对荷瘤小鼠抑瘤率和腹腔巨噬细胞吞噬能力,证明了总黄酮对小鼠S 180实体瘤有显著抑制作用,抑制肿瘤生长同时,可明显提高小鼠体重.菊叶总黄酮高剂量组可提高荷瘤小鼠的脾指数和胸腺指数;通过与环磷酰胺组和生理盐水组比较,证实菊叶总黄酮可使荷S 180实体瘤小鼠腹腔巨噬细胞吞噬能力显著升高,表明其没有免疫抑制作用.———————————————————参考文献:
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