五味子乙素对苯并芘致HTR8-SVneo细胞氧化损伤的保护作用

五味子乙素对苯并芘致HTR8-SVneo细胞氧化损伤的保护作
用
章艳燕;侯海燕;陈晓;陈亚琼
【摘要】目的:研究环境污染物苯并芘(BaP)致人绒毛膜滋养层细胞HTR8-SVneo 氧化损伤的作用机制,探讨五味子乙素(Sch B)的可能保护作用.方法:本实验分为空白组、BaP组、Sch B不同浓度组(0.1,0.5,2.0 μmol/L),以HTR8-SVneo细胞为载体,构建BaP氧化应激损伤模型,测定氧化和抗氧化指标.结果:与空白组比较,BaP组超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)的浓度显著降低,而乳酸脱氢酶(LDH)、丙二醛(MDA)、一氧化氮(NO)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的浓度明显增加(P＜0.05).不同剂量Sch B组SOD、GSH-Px的浓度明显提高,LDH、MDA、NO、iNOS的浓度减少,与BaP组比较,差异有统计学意义(P＜0.05).结论:Sch B能调节BaP所致的HTR8-SVneo细胞氧化系统和抗氧化系统的失衡,从而预防BaP致HTR8-SV neo细胞的氧化损伤.
【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》
【年(卷),期】2015(034)003
【总页数】3页(P181-183)
【关键词】苯并芘;五味子素;滋养层;超氧化物歧化酶;谷胱甘肽过氧化酶;L-乳酸脱氢酶;丙二醛;一氧化氮;一氧化氮合酶
【作者】章艳燕;侯海燕;陈晓;陈亚琼
【作者单位】300162 天津,中国人民武装警察部队后勤学院附属医院妇产
科;300162 天津,中国人民武装警察部队后勤学院附属医院妇产科;300162 天津,中国人民武装警察部队后勤学院附属医院妇产科;300162 天津,中国人民武装警察部
队后勤学院附属医院妇产科
【正文语种】中文
细胞氧化损伤的主要原因是由自由基和脂质过氧化物的大量堆积所造成的。

苯并芘（benzo［a］pyrene，BaP）是一种多环芳烃类环境污染物。

研究表明Bap在体内代谢过程中能产生大量活性氧簇（ROS），导致超氧化物歧化酶簇（SOD）和
谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性改变，造成细胞氧化损伤坏死［1］。

传统
保胎及提高生育力方剂“五子衍宗丸”中的君药——五味子，具有比人参和灵芝
更安全、更持久、更有效的抗氧化作用，其主要成分五味子乙素（Schizandrin B，Sch B）是五味子的一类提取物，可诱导细胞的抗氧化反应［2］。

本研究以人绒
毛膜滋养层细胞HTR8-SVneo为载体，探讨Sch B在预防BaP所致的HTR8-SVneo细胞氧化损伤中的作用及可能机制。

1.1 材料Sch B（中国药品生物制品检定所），BaP（美国Sigma公司），一氧化氮（NO）测试试剂盒（中国碧云天生物科技有限公司），乳酸脱氢酶（LDH）、SOD、GSH-Px、丙二醛（MDA）、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）测定试剂盒（南京建成生物科技公司）。

1.2 方法
1.2.1 人绒毛膜外滋养层细胞HTR8-SVneo细胞系由加拿大Graham教授惠赠。

培养于含10%胎牛血清，120 U/mL青钠霉素的RPMI 1640培养基中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱内。

待细胞贴壁并长满皿底85%左右进行给药：
①空白组，仅用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培养液培养细胞6 h，再更换相
同成分的培养液培养细胞24 h；②BaP组，先用仅含有10%胎牛血清的1640培养液培养6 h，再换含有20 μmol/L的BaP培养液培养细胞24 h；③Sch B不同剂量组，先用含有不同浓度（0.1，0.5，2.0 μmol/L）的Sch B培养液培养细胞6 h，再换含有20 μmol/L的BaP培养液培养细胞24 h。

收集细胞及其培养液，每组实验重复3次。

将获得的细胞制成细胞裂解液，同时将收集的细胞培养液离心待用。

1.2.2 选取对数生长期细胞接种于96孔板中，每孔100 μL（含1×104个细胞）细胞悬液，待细胞贴壁并长满皿底85%左右进行如上预处理，BaP孵育24 h后弃去药物及培养液，每孔加入120 μL MTS溶液，37℃孵育150 min。

用波长490 nm酶标仪检测各孔的光密度值（OD），以空白组为对照组，计算其平均值，细胞存活率计算公式如下：细胞存活率=给药组OD值/空白组OD值×100%
1.2.3 细胞培养液中的SOD、LDH、 GSH-Px、NO、iNOS以及细胞裂解液中MDA的浓度严格按照试剂盒说明书进行检测。

1.3 统计学方法采用SPSS 21.0软件进行统计分析。

定量资料以均数±标准差（）表示，空白组与BaP组比较采用两独立样本t检验，Sch B不同剂量组与BaP组比较采用单因素方差分析，组间多重比较采用LSD-t法。

检验水准为α=0.05。

2.1 各组细胞存活率比较与空白组比较，BaP组细胞存活率降低，差异有统计学意义（P＜0.05）；SchB不同剂量组与BaP组间比较差异有统计学意义（P＜
0.01），分别与BaP组两两比较差异均有统计学意义（均P＜0.01），HTR8-SVneo细胞存活率增加，见表1。

2.2 各组MDA、LDH、NO、iNOS浓度比较BaP组的MDA、LDH、NO、iNOS 浓度高于空白组（P＜0.05）；Sch B不同剂量组与BaP组间比较差异有统计学意义（P=0.000），与BaP组相比，Sch B不同剂量组中MDA、LDH、NO、iNOS 浓度降低（P＜0.05），见表2。

2.3 各组SOD、GSH-Px浓度比较BaP组中SOD、GSH-Px的浓度低于空白组（P＜0.05）；Sch B不同剂量组与BaP组间比较差异有统计学意义（P=0.000），与BaP组相比，Sch B不同剂量组中SOD、GSH-Px浓度增加（P＜0.05），见
表3。

3.1 BaP对细胞氧化损伤的影响BaP作为多环芳烃污染物，具有广泛的致畸、致
癌和致突变作用，具有高脂溶性和较强的氧化活性，可导致细胞氧化损伤而造成染色体畸形。

研究表明这与脂质过氧化损伤有关［3］。

MDA是氧自由基引起的脂质过氧化反应的终产物，是衡量脂质过氧化和氧自由基的指标。

LDH是体内能量代谢过程中的关键酶，其浓度可判断细胞受损程度。

本
研究对两者的检测表明，BaP可增加MDA、LDH的浓度。

这表明了BaP可使细
胞产生大量的氧自由基，使细胞发生脂质过氧化，造成细胞的氧化损伤。

研究证实BaP在体内的代谢产物可以干扰正常妊娠导致流产，并与胎儿头围减小、体质量
减轻、早产及出生缺陷的发生有关［4］。

NOS是NO合成过程中的限速酶，NOS的同功酶主要有内皮型NOS（eNOS）、iNOS和神经型NOS（nNOS）3种亚型。

一般情况下，iNOS处于不表达或低表达状态，但当机体受到损伤时可激活其表达，产生过量NO并聚积，而高水平的NO可损伤线粒体，干扰能量代谢和DNA合成，还可使高剂量的SOD丧失保护
作用，导致细胞死亡［5］。

本研究结果显示，BaP能增加iNOS和NO的浓度。

而高浓度NO具有细胞毒性作用，能够损伤胚胎，可造成细胞的氧化损伤［6］。

因此，抑制iNOS表达可阻碍NO产生以减少细胞凋亡［7］。

机体内存在一套完整有效的抗氧化酶防御系统，主要包括SOD、GSH-Px、过氧
化氢酶（CAT）等，其在维持机体氧化状态的动态平衡方面起到了十分重要的作用［8］。

GSH-Px是一种含硒清除自由基和抑制自由基反应的系统，对抑制体内自
由基引起膜脂质过氧化特别重要，可以清除ROS和羟自由基（·OH）诱发的脂质
过氧化物。

因此，这两种酶的浓度反映了细胞的抗氧化能力。

本研究结果显示，BaP能降低SOD、GSH-Px的浓度，这与Woo等［1］的研究结果一致，可见BaP能使细胞产生大量的ROS，导致SOD、GSH-Px浓度降低，造成细胞损伤。

3.2 不同浓度Sch B对细胞氧化损伤的作用五味子既可通过捕获氧自由基起到抗氧化作用［9］，亦可提高细胞内抗氧化系统相关酶GSH-Px和SOD的浓度以清除
自由基，减轻细胞损伤［10］。

Sch B属联苯环辛烯类木脂素，是五味子木脂素
的主要活性成分之一，具有保肝、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤等作用［2］。

本研究结果表明，Sch B可提高GSH-Px和SOD的浓度，减少氧化物质MDA、LDH的浓度和NO的生成量，同时下调iNOS的浓度，从而预防BaP对细胞造成的氧化
损伤。

这也验证了Sch B具有较强的抗氧化作用，主要包括提高GSH-Px［11-12］和SOD的浓度［11，13］，清除ROS［14］和降低MDA、LDH的浓度［12，15］，预防细胞受损等。

对于Sch B干预调控BaP致胚胎及绒毛损伤中的作用及机制还有待进一步研究，
这对阐明中药抗多环芳烃类环境污染物生殖毒性机制和开发高效的天然药物以实现优生、保护胚胎健康发育具有重要意义。

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