无内毒素养粒大提取试剂盒中文操作指南

无内毒素养粒大提取试剂盒中文操作指南（omega）
详细内容：® Fastfiler Endo-free Plasmid Maxiprep Protocol(无内毒素养粒大抽提)
1. 在1-4升的培育瓶中加入200-500ml LB培育基,然后加入菌种于37℃摇床培育12-16小时；
Tip:为取得最好的结果，请接种1ml培育留宿的菌种（12-16hr）。

并强烈推荐利用(endA-)品系用于常规的质粒提取，如DH5a和JM109。

注意：菌液的培育时刻不能超过16小时；
2. 搜集200ml培育基至适当的离心管，室温下，3,500-5,000×g 离心10分钟沉淀；
3. 吸尽并去除培育基，用干净的吸水纸吸尽壁上多余的液体。

加Solution I/RNase A到细菌培育物中，涡旋和枪头抽打细菌以重悬细胞；
注：充分重悬细菌沉淀物对取得高产量的质粒是相当关键的。

充分重悬后溶液是均匀的，不存在小块物质；请尽可能吸弃残余的培育基以避免稀释加入的溶液；
4. 加入SolutionII，轻轻倒置旋转混匀7-10次至取得澄清的裂解液；室温放置3-5分钟能够有是必需的。

幸免猛烈振荡混匀而打断染色体DNA，降低质粒的纯度。

（Solution II利用后请盖紧盖子且于室温保留）；
5. 将掏出Lysate Clearance Filter Syrine活塞，将其放置于架子上；
6. 加入12 ml Neutralization Buffer，轻轻倒置混匀几回至显现絮状沉淀。

这可能需要放置2-3分钟并中断倒置混匀；
7. 当即将裂解液转移到lysate Clearance Filter Syrine中，垂直放置5分钟。

这时白色的絮状沉淀物会漂上溶液的上层，裂解液可能开始流出过滤器，用新的50ml管子搜集细菌裂解液，并将活塞轻轻插入过滤器中；
8. 握住过滤器，轻轻推动活塞将裂解液打到搜集管中；注意不要将任何杂质打到搜集管中；
9. 加入体积的ETR Solution（蓝色）到搜集液中，轻轻倒置旋转混匀7-10次，冰浴放置20分钟；注意：加入ERT Solution后，溶液应变得浑浊，但冰浴静置后溶液应是澄清的。

10. 37℃孵育5分钟，溶液从头变成浑浊。

室温下，3,000×g离心5分钟，ERT Solution（蓝色）分层于离心管底部。

11. 把上面的水相（上清液）转移到新的50ml离心管中，加入1/3体积的GBT Buffer，轻轻倒置旋转混匀1-2次。

注意：转移上清液时不要吸到任何ETR溶液，因为其含有高浓度的内毒素；
12. 平稳DNA柱子：用HiBind DNA Maxi Column套在搜集管中，加入10ml Buffer GPS至HiBind DNA Maxi柱子中，室温下3000×g离心2分钟；去除滤过液并重复利用搜集管；
13. 加入23ml澄清的裂解液至DNA柱子中，3,000×g离心2分钟。

去除滤过液并从头搜集管；
14. 将剩余的裂解液加到柱子上，按上述条件离心，去除滤过液并从头利用搜集管；
15. 加入10ml Buffer HB至柱子中，3000×g离心2分钟，去除滤过液并从头利用搜集管；
16. 加入15ml DNA Wash buffer(已用乙醇稀释)至柱子中，3000×g 离心2分钟，去除滤过液并从头利用搜集管；
17. 加入10ml DNA Wash buffer至柱子中，3000×g离心5分钟，去除滤过液和搜集管；
18. 将柱子套在新的50ml离心管中，加入1-3ml DNA Elution Buffer 或水至柱子的基质。

室温下,3000×g离心洗脱DNA。

® Fastfilter Endo-free Plasmid Maxiprep Protocol(Vacuum Protocol)
1. 按1-11步骤预备澄清的裂解液；
2. 平稳柱子：将HiBind DNA Maxi Column同真空装置相连接，加入10ml Buffer GPS至柱子中，提供真空1分钟至裂解液完全滤过膜；
3. 将澄清的裂解液至HiBind DNA Maxi柱子中，提供真空让所有的溶液滤出柱子；加入10ml HB Buffer至柱子，提供真空吸尽液体；
4. 加入15ml DNA Wash buffer（已经用无水乙醇稀释）至柱子中，提供真空让溶液滤出柱子；
5. 重用15ml DNA Wash buffer至柱子中，提供真空让溶液滤出柱子；溶液滤出柱子后，将柱子转移至50ml搜集管中，另外提供真空10分钟，室温下，3000×g离心5分钟以洗脱DNA。

第二次洗脱可能是需要的；
6. 去除柱子，然后将产物保留于-20℃。