circTADA2A在肺腺癌组织和细胞中的表达及其对A549细胞迁移及侵袭影响的实验研究

ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在肺腺癌组织和细胞中的表达及其对Ａ５４９细胞迁移及侵袭影响的实验研究
朱秋霞１，陈晓东１，张　叶２，吴　荣１
ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｉｎｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｅｌｌｓａｎｄｉｔｓｅｆｆｅｃｔｏｎＡ５４９ｃｅｌｌｓｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ
ＺＨＵＱｉｕｘｉａ１，ＣＨＥＮＸｉａｏｄｏｎｇ１，ＺＨＡＮＧＹｅ２，ＷＵＲｏｎｇ
１１
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ＳｈｅｎｇｊｉｎｇＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ＬｉａｏｎｉｎｇＳｈｅｎｙａｎｇ１１００２２，Ｃｈｉｎａ；２ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＨｅａｄ＆
ＮｅｃｋＲａｄｉｏｔｈｅｒａｐｙ
，ＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＣｈｉｎａＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ／ＬｉａｏｎｉｎｇＣａｎｃｅｒＨｏｓｐｉｔａｌ＆Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＬｉａｏｎｉｎｇＳｈｅｎｙａｎｇ１１００４２，Ｃｈｉｎａ．【Ａｂｓｔｒａｃｔ】　Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｅｘｐｌｏｒｅｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｉｒｃｕｌａｒＲＮＡＴＡＤＡ２Ａ（ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ）ｉｎｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏ ｍａ（ＬＡＤ）ｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｅｌｌｓ，ａｎｄｉｓｔｏｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｏｎＡ５４９ｃｅｌｌｓｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ．Ｍｅｔｈ ｏｄｓ：ＴｈｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｃｉｒｃＲＮＡｓｄａｔａｏｆ５ＬＡＤｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｐａｉｒｅｄｐａｒａｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓｉｎＧＳＥ１０１５８６ｗａｓｄｏｗｎｌｏａｄｅｄｆｒｏｍＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）ｄａｔａｂａｓｅ．ＴｈｅｄａｔａｗａｓａｎａｌｙｚｅｄｂｙｏｎｌｉｎｅｓｏｆｔｗａｒｅＧＥＯ２Ｒ．Ｅｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｉｎＧＳＥ１０１５８６ｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＧＥＯ２Ｒ，ｅｉｔｈｅｒ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａｉｎａｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｌｉｎｅＡ５４９ａｎｄｉｎａｈｕｍａｎｎｏｒｍａｌｂｒｏｎｃｈｉａｌｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｌｉｎｅ１６ＨＢＥｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｑＲＴ－ＰＣＲ．ＳｐｅｃｉｆｉｃｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）ｔａｒｇｅｔｅｄｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ（ｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ）ａｎｄｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｓｃｒａｍｂｌｅｓｉＲＮＡ（ｓｉＳＣＲ）ｗｅｒｅｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｉｎｔｏＡ５４９ｃｅｌｌｓ，ｆｏｌｌｏｗｅｄｂｙａｑｕａｌｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｖｉａｑＲＴ－ＰＣＲ．ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｌｅｖｅｌｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｏｎｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｗｅｒｅｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｂｙＴｒａｎｓｗｅｌｌａｓｓａｙｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ａｔｏｔａｌｏｆ３９ｃｉｒｃＲＮＡｓｗｅｒｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＧＳＥ１０１５８６ｂｅｔｗｅｅｎＬＡＤａｎｄｐａｒａｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅ（ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎｃｒｉｔｅｒｉａ：Ｐ＜０．０５ａｎｄ｜ＬｏｇＦＣ｜ｖａｌｕｅ≥１．２）．Ａｍｏｎｇｗｈｉｃｈ，２２ｃｉｒｃＲＮＡｓｗｅｒｅｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄ，ａｎｄ１７ｃｉｒｃＲＮＡｓｗｅｒｅｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｅｄ．ｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｗａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎＬＡＤｔｉｓｓｕｅｓａｓｃｏｍｐａｒｉｎｇｗｉｔｈｔｈａｔｉｎｐａｒａｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓ．Ｍｅａｎｗｈｉｌｅ，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｗａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓａｓｃｏｍｐａｒｉｎｇｗｉｔｈｔｈａｔｉｎ１６ＨＢＥ．ＡｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａｓｕｐ ｐｒｅｓｓｅｄｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ．ＡｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａｉｎｈｉｂｉｔｅｄｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎａ ｂｉｌｉｔｙｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｗａｓｕｐｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎＬＡＤ，ａｎｄａｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｉｎｈｉｂｉｔｅｄｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎａｂｉｌｉｔｙｏｆＡ５４９ｃｅｌｌｓ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】ｃｉｒｃｕｌａｒＲＮＡＴＡＤＡ２Ａ，ｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，ｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓ
ＭｏｄｅｒｎＯｎｃｏｌｏｇｙ２０２１，２９（０９）：１４９６－１５００
【摘要】　目的：研究环状ＲＮＡＴＡＤＡ２Ａ（ｃｉｒｃｕｌａｒＲＮＡＴＡＤＡ２Ａ，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ）在肺腺癌（ｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＬＡＤ）组织和细胞中的表达及其对Ａ５４９细胞迁移及侵袭的影响。

方法：在ＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）数据库中下载非编码ＲＮＡ阵列分析文件ＧＳＥ１０１５８６，并通过在线分析软件ＧＥＯ２Ｒ分析ＧＳＥ１０１５８６中５例肺腺癌及配对的癌旁组织中差异表达的环状Ｒ
ＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｒＲＮＡｓ，ｃｉｒｃＲＮＡｓ）；筛选差异表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓ并绘制热图；检测ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在ＧＳＥ１０１５８６的５例肺腺癌及配对的癌旁组织中的差异性表达；ｑＲＴ－ＰＣＲ法检测ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在非小细胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ）细胞系Ａ５４９及人支气管上皮细胞系１６ＨＢＥ中的差异表达；在Ａ５４９细胞中转染特异性ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ干扰寡核苷酸（ｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ，ｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ），同步转染错义对照寡核苷酸（ｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇｓｃｒａｍｂｌｅ，ｓｉＳＣＲ），ｑＲＴ－ＰＣＲ法检测ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的差异表达；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ迁移及侵袭实验检测不同ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ表达水平对Ａ５４９细胞迁移及侵袭能力的影响。

结果：在ＧＳＥ１０１５８６中，相比于癌旁组织，在肺腺癌组织中差异表达显著的ｃｉｒｃＲＮＡｓ有３９个（筛选标准：Ｐ＜０．０５且｜ｌｏｇＦＣ｜≥１
．２），其中上调的ｃｉｒｃＲＮＡｓ有２２个，下调的ｃｉｒｃＲＮＡｓ有１７个；相比于癌旁【收稿日期】　２０２０－０５－２６【修回日期】　２０２０－０６－３０
【基金项目】　吴阶平医学基金会临床科研专项资助基金（编号：３２０．６７５０．１９０９３－１３）【作者单位】
　１中国医科大学盛京医院肿瘤科，辽宁　沈阳　１１００２２２
中国医科大学肿瘤医院＆辽宁省肿瘤医院头颈放疗科，辽宁　沈阳　１１００４２
【作者简介】　朱秋霞（１９８８－），女，河北人，医师，主要从事恶性肿瘤的放化疗研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈｕｑｉｕｘ＠１２６．ｃｏｍ
【通讯作者】　吴荣（１９６２－），女，江苏人，教授，主任医师，主要从事恶性肿瘤的放化疗研究。

Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｕｒ＠ｓｊ－ｈｏｓｐｉｔａｌ．ｏｒｇ
·６９４１·朱秋霞，等 ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在肺腺癌组织和细胞中的表达及其对Ａ５４９细胞迁移及侵袭影响的实验研究
组织，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在肺腺癌组织中表达升高；相比于１６ＨＢＥ细胞，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在Ａ５４９细胞中表达升高；转染ｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ可明显敲低Ａ５４９细胞内ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达水平；下调ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达水平可明显抑制Ａ５４９细胞的迁移及侵袭能力。

结论：ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在肺腺癌组织和细胞中表达增高，下调其表达可明显抑制Ａ５４９细胞的迁移及侵袭能力。

【关键词】环状ＲＮＡＴＡＤＡ２Ａ；肺腺癌；侵袭转移
【中图分类号】Ｒ７３４．２ 【文献标识码】Ａ ＤＯＩ：１０．３９６９／ｊ．ｉｓｓｎ．１６７２－４９９２．２０２１．０９．００６
【文章编号】１６７２－４９９２－（２０２１）０９－１４９６－０５
肺癌是世界范围内导致癌症相关死亡的主要病因，同时，关于肺癌的研究也是目前肿瘤研究领域的热点［１］。

从病理类型上来说，肺癌可分为小细胞肺癌（ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃ ｅｒ，ＳＣＬＣ）和非小细胞肺癌（ｎｏｎ－ｓｍａｌｌｃｅｌｌｌｕｎｇｃａｎｃｅｒ，ＮＳＣＬＣ）两类。

肺腺癌（ｌｕｎｇａｄｅｎｏｃａｒｃｉｎｏｍａ，ＬＡＤ）作为非小细胞肺癌中的一个主要病理学亚类，在非小细胞肺癌中占比约６０％，在全部肺癌中占比约４０％［２－３］。

随着放射学、分子生物学及肿瘤学等的迅速发展，对于肺腺癌的诊疗已经取得了巨大的进步。

由于超过７０％的肺癌病人在首次就诊时就已经合并肿瘤的远处转移［４］，疗效及预后不佳。

因此，找到新的与肺癌侵袭转移相关的分子生物学标志物对于临床医生和科研工作者来说仍然十分迫切。

环状ＲＮＡ（ｃｉｒｃｕｌａｒＲＮＡｓ，ｃｉｒｃＲＮＡｓ）隶属于非编码ＲＮＡ（ｎｏｎ－ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ）家族，是近年来非编码ＲＮＡ研究领域的新宠之一。

ｃｉｒｃＲＮＡｓ在人类转录本中广为存在和表达，且由于其特殊的结构，ｃｉｒｃＲＮＡｓ展现出了多种不同的生物学功能［５－６］。

ｃｉｒｃＲＮＡｓ结构稳定且表达具有一定的组织特异性［７］。

ｃｉｒｃＲＮＡｓ广泛参与了包括肺腺癌在内的多种肿瘤的多个生物学行为过程［８－１１］。

在本文中，我们关注了ＧｅｎｅＥｘ ｐｒｅｓｓｉｏｎＯｍｎｉｂｕｓ（ＧＥＯ）数据库中肺腺癌内差异表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓ的情况，通过在线分析软件ＧＥＯ２Ｒ，我们分析了ＧＳＥ１０１５８６的５例肺腺癌及配对癌旁组织中差异表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓ，且重点关注了这５例配对样本中ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达，同时我们在细胞学水平对ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ与Ａ５４９细胞迁移和侵袭进行了初步探讨。

我们的实验研究拟为分子靶向治疗肺腺癌的开展提供新的理论靶标并提供了一定的实验基础。

１　材料与方法
１．１　材料
人支气管上皮细胞株１６ＨＢＥ和人非小细胞肺癌细胞株Ａ５４９均购自中科院上海细胞库；ＤＭＥＭ培养基、胎牛血清（ｆｅｔａｌｂｏｖｉｎｅｓｅｒｕｍ，ＦＢＳ）购自美国Ｇｉｂｃｏ公司；ＴＲＩｚｏｌ购自美国Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ公司；ＲｎａｓｅＲ酶购自美国ＥｐｉｃｅｎｔｒｅＢｉｏ公司；ＧｏｓｃｒｉｐｔＴＭＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ试剂盒及ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂盒均购自美国Ｐｒｏｍｅｇａ公司；ＲｉｂｏＦＥＣＴＴＭＣＰ转染试剂盒购于广州市锐博生物科技有限公司；Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室购于美国Ｔｈｅｒｍｏ－Ｆｉｓｈｅｒ公司；特异性ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ干扰寡核苷酸（ｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｓｍａｌｌｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇＲＮＡ，ｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ）及对应的错义对照寡核苷酸（ｓｍａｌｌｉｎ ｔｅｒｆｅｒｉｎｇｓｃｒａｍｂｌｅ，ｓｉＳＣＲ）购自上海吉玛基因公司；引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

１．２　实验方法
１．２．１　ＧＥＯ数据的下载及在线ＧＥＯ２Ｒ分析　从美国ＧＥＯ公共数据库（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／）中下载肺癌中失常表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓ表达谱矩阵文件ＧＳＥ１０１５８６（ｈｔｔｐｓ：／／ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｏ／ｑｕｅｒｙ／ａｃｃ．ｃｇｉ？ａｃｃ＝ＧＳＥ１０１５８６），分别设定对照组（Ｐａｒａｔｕｍｏｒ组）和肺腺癌组
（ＬＡＤ组），采用在线分析软件ＧＥＯ２Ｒ对这两组中失常表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓ进行分析，差异探针的筛选标准为Ｐ＜０．０５且｜ｌｏｇＦＣ｜≥１．２，其中ｌｏｇＦＣ≥１．２为高表达，ｌｏｇＦＣ≤－１．２为低表达。

１．２．２　细胞培养　人支气管上皮细胞株１６ＨＢＥ和人非小细胞肺癌细胞株Ａ５４９均培养于添加１０％胎牛血清、１００μｇ／ｍＬ青霉素和０．１ｍｇ／ｍＬ链霉素的ＤＭＥＭ培养基中，并置于３７℃、５％ＣＯ
２
的恒温培养箱中进行培养。

待细胞生长至７０％～８０％融合时，以０．２５％胰蛋白酶进行消化并按１∶３比例进行传代。

１．２．３　细胞转染　取生长状态良好的Ａ５４９细胞，０．２５％胰蛋白酶消化并调整细胞密度为２×１０５个细胞／孔接种于６孔板中。

按照ＲｉｂｏＦＥＣＴＴＭＣＰ转染试剂盒的说明书将特异性ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ干扰寡核苷酸（ｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ）及对应的错义对照寡核苷酸（ｓｉＳＣＲ）转染到Ａ５４９细胞中，并进行后续的ｑＲＴ－ＰＣＲ检测。

ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ干扰寡核苷酸序列如下：ＣＣＡＵＵＵＣＡＣＵＧＣＡＧＧＡＵＧＵｄＴｄＴ；错义对照寡核苷酸序列如下：ＵＵＣＵＣＣＧＡＡＣＧＵＧＵＣＡＣＧＵＴＴ。

１．２．４　ＲｎａｓｅＲ处理及ｑＲＴ－ＰＣＲ检测ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达　参照ＴＲＩｚｏｌ试剂说明书提取目的细胞的总ＲＮＡ，为有效检测ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达，每１０００ｎｇ总ＲＮＡ加入３Ｕ的ＲｎａｓｅＲ酶３７℃孵育１０ｍｉｎ以消化线性ＲＮＡ。

之后采用ＧｏｓｃｒｉｐｔＴＭＲｅｖｅｒｓｅＴｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎＳｙｓｔｅｍ试剂盒反转录合成ｃＤＮＡ，产物采用ＧｏＴａｑ ｑＰＣＲＭａｓｔｅｒＭｉｘ试剂盒进行ｑＰＣＲ扩增，具体过程按照说明书进行。

采用β－ａｃｔｉｎ作为内参照。

引物序列如下：β－ａｃｔｉｎｆｏｒｗａｒｄ５＇－ＧＧＧＡＡＡＴＣＧＴＧＣＧＴＧＡＣＡＴＴＡＡＧ－３＇，β－ａｃｔｉｎｒｅｖｅｒｓｅ５＇－ＴＧＴＧＴＴＧＧＣＧＴＡＣＡＧＧＴＣＴＴＴＧ－３＇；ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａｆｏｒｗａｒｄ５＇－ＴＧＴＧＣＡＣＣＡＡＧＡＣＣＡＡＧＧＡＧ－３＇，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａｒｅｖｅｒｓｅ５＇－ＡＧＧＡＡＡＡＴＣＴＧＡＡＧＴＡＧＴＧＡ－３＇。

采用２－ΔΔＣｔ法计算ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的相对表达量。

１．２．５　Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ检测Ａ５４９细胞侵袭及迁移能力变化　采用文献报道的方法进行操作［１２］，简述如下：常规包被底部膜，水化；同步化各组Ａ５４９细胞，调整计数为１．５×１０４并接种于上室内，上室内加入１００μＬ含１０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养基；下室内加入５００μＬ含２０％胎牛血清的ＤＭＥＭ培养
基，３７℃、５％ＣＯ
２
孵育４８ｈ。

取出Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室，棉签擦去Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室内部细胞，冲洗，固定，染色，倒置显微镜下观察并计数。

每组铺６个Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ小室，平均值即细胞侵袭的数量。

计算每组６孔的侵袭细胞数。

１．３　统计学方法
数据由ＳＰＳＳ１６．０统计软件处理，实验结果以（珋ｘ±ｓ）表示，两组间分析采用ｓｔｕｄｅｎｔｔ检验或方差分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。

２　结果
·
７
９
４
１
·
现代肿瘤医学　２０２１年０５月　第２９卷第０９期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｙ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０９
２．１　ｃｉｒｃＲＮＡｓ在肺腺癌中的差异表达
我们应用在线分析软件ＧＥＯ２Ｒ分析了非编码ＲＮＡ阵列分析文件Ｇ
ＳＥ１０１５８６中差异表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓ，结果发现，相比于配对的癌旁组织，在肺腺癌组织中差异表达显著的
ｃｉｒｃＲＮＡｓ有３９个（筛选标准：Ｐ＜０．０５且｜ｌｏｇＦＣ｜≥１．２），其中上调的ｃｉｒｃＲＮＡｓ有２２个，下调的ｃｉｒｃＲＮＡｓ有１７个；在上调的ｃ
ｉｒｃＮＲＡｓ中，以ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ（探针ＩＤ：ＡＳＣＲＰ００２３８４）变化倍数最为明显，见表１及图１。

表１　ＧＳＥ１０１５８６中差异表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓＴａｂ．１　ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄｃｉｒｃＲＮＡｓｉｎＧＳＥ１０１５８６
ＩＤ
Ａｄｊ．ＰＰｔＢＬｏｇＦＣＳＰＯＴ＿ＩＤＡＳＣＲＰ００２３８４
０．６０６
０．００２６
３．８０９６
－４．０４
２．６５４６
ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０２０４９
ＡＳＣＲＰ００２３８６０．６０６０．００７３３．２４２６－４．１４２．５６７３ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０２０５１ＡＳＣＲＰ００４０９９０．６０６０．００２０３．９６３０－４．０２２．５１３８ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０３８０９ＡＳＣＲＰ００２９３２０．６０６０．０２３６２．６０２０－４．２７２．４５０９ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０２６１９ＡＳＣＲＰ００４５４００．６０６０．００８２３．１７８３－４．１５２．４５０７ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０４２７０ＡＳＣＲＰ００１２０７０．６０６０．００５３３．４１６０－４．１１１．８９８１ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１００８３３ＡＳＣＲＰ００２５５９０．５８８０．０００２５．４５７８－３．８４１．６６９３ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０２２３１ＡＳＣＲＰ０００３８９０．６０６０．０２１６２．６４８７－４．２６１．５５３５ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿００２１７２ＡＳＣＲＰ００１２０８０．６０６０．０１６９２．７８３４－４．２３１．４９１６ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１００８３４ＡＳＣＲＰ００２３６９０．６０６０．００８２３．１７６５－４．１５１．４８０４ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０２０３４ＡＳＣＲＰ００３８９００．６０６０．００６４３．３１５１－４．１３１．４６６１ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０３５９５ＡＳＣＲＰ００１９４２０．６０６０．００５６３．３８６０－４．１２１．４６０２ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０１５９２ＡＳＣＲＰ００４７５３０．６０６０．０１０７３．０３２５－４．１８１．４４２８ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０４４９９ＡＳＣＲＰ００１４５３０．６０６０．０２８５２．４９８０－４．２９１．３９４２ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０１０８５ＡＳＣＲＰ００３６４６０．６０６０．００５８３．３６９６－４．１２１．３９３８ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０３３４８ＡＳＣＲＰ００１００７０．６０６０．０３８４２．３３３２－４．３３１．３８９９ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１００６３３ＡＳＣＲＰ００１７２６０．６０６０．０４１６２．２８７９－４．３４１．３４０８ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０１３６７ＡＳＣＲＰ００４２６７０．６０６０．０１７９２．７５２２－４．２４１．３２４７ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０３９８７ＡＳＣＲＰ０００３９００．６０６０．０２２１２．６３６２－４．２６１．２６７８ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿００２１７８ＡＳＣＲＰ００１８４６０．６０６０．０３９６２．３１６１－４．３３１．２６７３ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０１４９５ＡＳＣＲＰ０００５３５０．６０６０．０１１０３．０１９４－４．１８１．２５１１ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１００１４６ＡＳＣＲＰ００３４２７０．６０６０．０１８８２．７２５４－４．２４１．２４９５ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０３１２３ＡＳＣＲＰ０００１４００．６０６０．０３０１－２．４６７４－４．３０－１．２３５１ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿０００８６４ＡＳＣＲＰ００３４３７０．６０６０．０１０６－３．０３７１－４．１８－１．２４８９ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０３１３４ＡＳＣＲＰ０００１６７０．６０６０．０１１２－３．００９７－４．１９－１．２９０６ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿０００９６３ＡＳＣＲＰ００２３８００．６０６０．０２１３－２．６５７６－４．２６－１．２９９７ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０２０４５ＡＳＣＲＰ００５２６００．６０６０．００６１－３．３４１５－４．１２－１．３２７１ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０５０１３ＡＳＣＲＰ０００３０２０．６０６０．０２７５－２．５１７０－４．２９－１．３２７８ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿００１５８７ＡＳＣＲＰ００１５７６０．６０６０．０００８－４．４９０７－３．９５－１．３２８９ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０１２１３ＡＳＣＲＰ０００２５３０．６０６０．０１５１－２．８４５４－４．２２－１．３６７５ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿００１３５０ＡＳＣＲＰ００１６４３０．６０６０．００６６－３．２９６３－４．１３－１．３７２５ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０１２８２ＡＳＣＲＰ００４６０５０．６０６０．００１３－４．１９３３－３．９９－１．４４８９ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０４３４２ＡＳＣＲＰ００１６６７０．６０６０．０４４１－２．２５５４－４．３５－１．４９９１ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０１３０８ＡＳＣＲＰ００２３８１０．６０６０．０２９４－２．４８１３－４．３０－１．５１８２ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０２０４６ＡＳＣＲＰ００１０３４０．６０６０．００７６－３．２２０８－４．１５－１．５８１９ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１００６６０ＡＳＣＲＰ００４７６７０．５８８０．０００３－５．０６５４－３．８８－１．７６０４ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０４５１３ＡＳＣＲＰ００２７６１０．６０６０．０３８０－２．３３８８－４．３３－１．７８７２ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０２４４２ＡＳＣＲＰ００４３９９０．５８８０．０００４－４．８９４４－３．９０－１．８１００ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１０４１２６ＡＳＣＲＰ０００７７９
０．６０６
０．０１３６
－２．９０２１
－４．２１
－１．８１８４
ｈｓａ＿ｃｉｒｃＲＮＡ＿１００３９
５
图１　肺腺癌中差异表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓＦｉｇ．１　ＤｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｌｅｘｐｒｅｓｓｅｄｃｉｒｃＲＮＡｓｉｎＬＡＤ
·８９４１·朱秋霞，等 ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在肺腺癌组织和细胞中的表达及其对Ａ５４９细胞迁移及侵袭影响的实验研究
２．２　ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在肺腺癌组织及Ａ５４９细胞中高表达我们通过在线分析软件ＧＥＯ２Ｒ分析了ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在非编码ＲＮＡ阵列分析文件ＧＳＥ１０１５８６中的差异表达情况，结果显示，相比于配对的癌旁组织，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在５例肺腺癌组织中表达明显升高（Ｐ＝０．０３９１），见图２Ａ；我们进一步通过ｑＲＴ－ＰＣＲ法检测了ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在１６ＨＢＥ和Ａ５４９细胞中的表达，结果显示，相比于１６ＨＢＥ细胞，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在Ａ５４９细胞中的表达水平明显升高（Ｐ＜０．００１），见图２Ｂ。

图２　ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在肺腺癌组织（Ａ）及细胞（Ｂ）中的表达
Ｆｉｇ．２　ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｉｎＬＡＤｔｉｓｓｕｅｓ（Ａ）ａｎｄｃｅｌｌｓ（Ｂ）
２．３　转染ｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ可抑制Ａ５４９细胞内ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达
我们通过细胞转染的方式将ｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ转染到Ａ５４９细胞中，同步转染ｓｉＳＣＲ作为对照。

ｑＲＴ－ＰＣＲ检测结果显示，相比于转染ｓｉＳＣＲ，转染ｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ可明显敲低Ａ５４９细胞内ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达水平，证实转染成功（Ｐ＜０．０１），见图３。

２．４　下调ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达可抑制Ａ５４９细胞的迁移及侵袭能力
我们通过Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ迁移及侵袭实验检测了ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ表达水平对Ａ５４９细胞迁移及侵袭能力的影响，结果显示，相比于ｓｉＳＣＲ转染组，ｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ转染组（即下调ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ）Ａ５４９细胞的迁移及侵袭能力明显受到了抑制（Ｐ＜０．０１），见图４。

　图３　转染ｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ可明显抑制Ａ５４９细胞内ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达
Ｆｉｇ．３　ＴｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｓｉｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｋｎｏｃｋｅｄｄｏｗｎｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｉｎＡ５４９ｃｅｌｌ
ｓ
图４　下调ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达可抑制Ａ５４９细胞的迁移及侵袭能力（结晶紫染色×２００）
Ｆｉｇ．４　ＡｋｎｏｃｋｄｏｗｎｏｆｃｉｒｃＴＡＤＡ２ＡｓｕｐｐｒｅｓｓｅｄｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎｉｎＡ５４９ｃｅｌｌｓ（ｃｒｙｓｔａｌｖｉｏｌｅｔｓｔａｉｎｉｎｇ×２００）
３　讨论
肺腺癌是非小细胞肺癌中最常见的病理类型。

大部分
肺腺癌都来源于支气管上皮细胞，一小部分肺腺癌则是来源
于伴有腺样体分化或黏液分泌特性支气管黏液腺［１３］。

同大
部分恶性肿瘤一样，肺腺癌的远处转移是导致病人死亡的主
要原因［１４］。

非编码ＲＮＡ是一大类不具备或具有非常有限
蛋白质编码能力的转录本［１５］。

非编码ＲＮＡ家族成员包括
微小ＲＮＡ（ｍｉｃｒｏＲＮＡ，ｍｉＲＮＡ）、长链非编码ＲＮＡ（ｌｏｎｇｎｏｎ
ｃｏｄｉｎｇＲＮＡ，ｌｎｃＲＮＡ）、ｃｉｒｃＲＮＡｓ等多个家族成员［１６－１９］。

ｃｉｒｃＲＮＡｓ是一类不同于线性ＲＮＡ的不具有３＇和５＇端的闭合
环状结构的转录本。

ｃｉｒｃＲＮＡｓ最早于１９７６年在Ｓａｎｇｅｒ测序
时被发现。

但直到近年，随着ＲＮＡ测序的快速发展，ｃｉｒｃＲＮＡｓ
·
９
９
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１
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现代肿瘤医学　２０２１年０５月　第２９卷第０９期 ＭＯＤＥＲＮＯＮＣＯＬＯＧＹ，Ｍａｙ２０２１，ＶＯＬ ２９，Ｎｏ ０９
在基因的表达调控及其在包括肿瘤在内的多种疾病中的重要作用重新得到了重点关注［２０］。

ｃｉｒｃＲＮＡｓ在肿瘤性疾病中广为表达且广泛参与了多种肿瘤（包括增殖、凋亡、细胞周期、侵袭转移、自噬、耐药等）的多种病理学过程［９，２１－２３］。

ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ是由转录适配器２Ａ（ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌａｄａｐｔｏｒ２Ａ，ＴＡＤＡ２Ａ）基因的５号和６号外显子环化而成。

ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ位于人１７号染色体，其在基因组的位置是ｃｈｒ１７：３５７９７８３８－３５８００７６３＋，其成熟体的长度为２５０ｂｐ［２４］。

目前关于ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的研究不多。

国内学者ＷＵ等［２４］研究发现，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在骨肉瘤中表达升高，下调ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ可抑制骨肉瘤细胞的增殖、侵袭及转移能力，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ可通过调控ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ／ｃＡＭＰ反应元件结合蛋白３（ｃＡＭＰｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅｅｌｅｍｅｎｔｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ３，ＣＲＥＢ３）的方式促进骨肉瘤的进展。

在另一项研究中，ＸＵ等［２５］报道，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在乳腺癌中表达降低，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ可通过吸附ｍｉＲ－２０３ａ－３ｐ的方式抑制细胞因子信号转导抑制物３（ｓｕｐｐｒｅｓｓｏｒｏｆｃｙｔｏｋｉｎｅｓｉｇｎａｌｉｎｇ３，ＳＯＣＳ３）的表达并抑制乳腺癌增殖及侵袭转移。

在本研究中，我们分析了５例肺腺癌及配对癌旁组织中差异表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓ。

结果发现，在２２个上调的ｃｉｒｃＲＮＡｓ中（筛选标准：Ｐ＜０．０５且｜ｌｏｇＦＣ｜≥１．２），ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的变化最为明显（变化倍数：２．６５４６倍）。

同时，我们通过ｑＲＴ－ＰＣＲ法在细胞学水平验证ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ的表达。

结果发现，相比于人支气管上皮细胞系１６ＨＢＥ，ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在人非小细胞肺癌细胞系Ａ５４９细胞中表达明显升高（Ｐ＜０．００１）。

以上组织学及细胞学检测结果初步提示：ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在肺腺癌中表达增高，预示其在肺腺癌的发生发展过程中可能发挥了功能。

我们进一步通过功能缺失实验（ｌｏｓｓｏｆｆｕｎｃｔｉｏｎａｓｓａｙ）考查了ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ对Ａ５４９细胞迁移侵袭能力的影响。

结果发现，当我们通过ＲＮＡｉ的方式下调ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ后，Ａ５４９细胞的迁移及侵袭能力受到了明显抑制。

我们的研究结果提示ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ可能参与肺腺癌的侵袭迁移。

肿瘤的侵袭迁移是一个涉及到细胞黏附力的丢失、细胞外基质的降解以及细胞迁移等的极为复杂的生物学过程。

我们的研究初步探讨了肺腺癌中失常表达的ｃｉｒｃＲＮＡｓ的情况，并初步研究了ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在Ａ５４９细胞迁移及侵袭中的作用。

表明ｃｉｒｃＲＮＡｓ可通过多种机制发挥其生物学作用，但ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在肺腺癌中的作用机制还需要进一步深入研究探讨。

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ＳＯＣＳ３ａｘｉｓ［Ｊ］．ＣｅｌｌＤｅａｔｈＤｉｓ，２０１９，１０：１７５．
（编校：张西敏）
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·朱秋霞，等 ｃｉｒｃＴＡＤＡ２Ａ在肺腺癌组织和细胞中的表达及其对Ａ５４９细胞迁移及侵袭影响的实验研究。