斑蝥素对hel细胞株jak2基因表达的影响研究及复方斑蝥胶囊治疗真性红细胞增..

提要
第一部分实验研究
目的：研究中药提取物斑蝥素对人骨髓增殖性肿瘤HEL细胞株增殖的影响，以及其对JAK2基因表达情况的影响，以期阐明斑蝥素抗肿瘤的作用，并阐明其作用机制是否与其通过调控JAK2基因的表达有关。

方法：采用MTT法证实斑蝥素抑制HEL细胞株增殖的确切作用；采用RT-PCR半定量法检测不同浓度斑蝥素对HEL细胞株JAK2基因的表达情况的影响。

结果：斑蝥素可抑制HEL细胞增殖，具有明显的时间和剂量相关性；空白组与中剂量斑蝥素组之间、空白组与高剂量斑蝥素组之间以及中高剂量斑蝥素组之间JAK2基因的表达量比较均具有显著差异性（P<0.01）；中剂量斑蝥素组、高剂量斑蝥素组均能降低JAK2基因的相对表达量（P<0.01）；高剂量组JAK2基因的相对表达量低于中剂量组（P<0.01）。

结论:斑蝥素抑制HEL细胞株增殖作用与其下调JAK2基因的表达有关。

第二部分临床研究
目的：观察复方斑蝥胶囊联合西药对真性红细胞增多症（PV）患者的临床疗效。

方法：40例PV患者按1:1比例随机分为对照组和实验组两组，每组20例，对照组采用常规西药治疗，实验组在常规西药治疗的基础上加用复方斑蝥胶囊，疗程3个月，观察临床疗效。

结果：实验组和对照组年龄（P=0.160）、性别（P=0.749）、病程（P=0.778）比较无显著差异，具有可比性。

治疗前两组血红蛋白及三系比较均无统计学意义（P ＞0.05），具有可比性。

治疗后总疗效比较，总有效率实验组90%，对照组84%，差异无统计学意义（P=0.179）；两组症候疗效比较（P=0.037）、症候总积分比较（P=0.009），具有显著统计学差异；两组血红蛋白含量比较（P=0.037）、血小板数值比较（P=0.045）、白细胞数值比较（P=0.001）、红细胞数值比较（P=0.006），差异均具有统计学意义。

结论：中药复方斑蝥胶囊联合西药能提高患者的疗效。

同时在临床观察中我们也发现，中药联合西药组可以明显改善患者的不良反应及与疾病相关的症状，提高患者的生存质量。

关键词 斑蝥素；骨髓增殖性肿瘤；HEL；JAK2；复方斑蝥胶囊；真性红细胞增多症
The Effection of Cantharidin on Tumor Cell Proliferation in MPN and Clinical Curative Effects of Compound BanMao Capsule to PV
Patients
Special: Internal Medicine of Integrated TCM
Student: Wang Yuhui
Tutor: Prof. Xu Ruirong
ABSTRACT
Part1 Experimental study
Objective: Study the influence of cantharidin of Chinese medicine extract to tumor proliferation on HEL cells, and detector the expression of JAK2 gene, in order to know the influence of cantharidin to clarify anti-tumor effect, and expounds the relevance between its mechanism and the expression of JAK2 gene.Methods: By MTT method to affirm the inhibition of proliferation of cantharidin to the HEL cell.The RT-PCR half quantitative method to detect different concentrations of cantharidin HEL cell lines JAK2 gene expression of the influence of the situation.Result: Cantharidin inhibits HEL cell proliferation, significant time and dose effect; JAK2 gene expression of the quantity is all has significant difference between blank group and dose of cantharidin group, blank group and between high doses of cantharidin between high doses of cantharidin and between groups（P<0.01）;Both dose of cantharidin group and high doses of cantharidin group can reduce the relative expression of JAK2 gene(P < 0.01); The relative expression of JAK2 gene of high dose group is less than the dose group (P < 0.01).Conclution: The thing that cantharidin can inhibit proliferation of HEL cell lines relevanted to it can reduce the JAK2 gene expression.
Part2 Clinical research
Objective: Research compound BanMao capsule with western medicine on the clinical Effectiveness in patients with PV.Methods: 40 patients with PV were sorted to
two groups of experimental group and control group in 1:1 proportion and random.Control group is given routine western medicine,experiment group is given routine western medicine combined with compound BanMao capsule,Observe the clinical effectiveness after 3months.Results:The difference of Age (P=0.160), gender (P=0.749) and duration (P=0.778) between experimental group and control group there were no significant differences in comparable have no statistical sense; Two groups of hemoglobin and three department are both no significant differences (P>0.05),and are comparable..After treatment, the difference about the total curative effect comparison, the total effective rate of the experiment group were 90% and control group is 84%, the difference was not statistically significant (P=0.179).Syndrome of two groups is (P = 0.037), total score syndrome (P = 0.009), all has a statistically significant difference. Hemoglobin content of Two groups is (P = 0.037), platelet numerical comparison (P = 0.045), white numerical comparison (P = 0.001), numerical comparison red blood cells (P = 0.006), all have a statistically significant difference.Conclution: Compound BanMao capsule combined with western medicine can improve the curative effect in PV patients. At the same time in the clinical observation we also found, traditional Chinese medicine combined with western medicine group can significantly improve patients with adverse reactions and the disease and related symptoms, and improve the quality of life of the patients
Key words Cantharidin；HEL； MPN；Compound BanMao capsule；PV
目 录
引 言 (1)
第一部分实验研究 (4)
一、主要仪器和材料 (4)
（一）主要仪器 (4)
（二）主要试剂 (4)
（三）主要耗材 (5)
二、主要试剂配制 (6)
三、实验过程 (6)
（一）细胞培养 (6)
（二）生长抑制率测定（MTT实验） (7)
四、RT-PCR法检测JAK2基因的表达 (8)
（一）加药 (8)
（二）细胞总RNA提取 (8)
（三）总RNA含量的测定（紫外分光光度计） (8)
（四）RT-PCR一步法反应 (8)
五、统计学分析 (10)
六、实验结果 (10)
（一）细胞增殖能力检测（MTT实验） (10)
（二）加药培养24h、48h后观察细胞形态 (11)
（三）RT-PCR半定量检测JAK2基因表达情况 (12)
讨 论 (14)
一、JAK2基因突变在骨髓增殖性疾病中的重要作用 (14)
二、HEL细胞株对MPN的研究的意义 (14)
三、中医学对MPN的认识 (15)
（一）病因 (15)
（三）治疗原则 (16)
四、斑蝥素对恶性肿瘤的作用 (16)
（一）诱导肿瘤细胞的凋亡 (17)
（二）抑制肿瘤细胞的增殖 (17)
（三）抑制肿瘤细胞的迁移 (17)
（四）升高白细胞，提高机体免疫力 (18)
五、实验结果分析 (18)
结 语 (19)
第二部分临床研究 (20)
一、临床资料 (20)
（一）病例来源 (20)
（二）诊断标准 (21)
（三）病例选择 (22)
二、治疗方法 (22)
（一）西药对照组 (22)
（二）中西医结合治疗组 (23)
三、观察指标和疗效评价 (23)
（一）疗效标准 (23)
（二）外周血血细胞计数 (24)
（三）安全指标 (24)
（四）统计学方法 (24)
四、研究结果 (25)
（一）临床疗效及中医症候比较 (25)
（二）血红蛋白及三系细胞变化情况比较 (26)
（三）治疗后两组毒副作用结果： (29)
讨论 (30)
一、祖国医学对骨髓增殖性肿瘤的认识 (30)
（一）骨髓增殖性疾病的中医归属 (30)
（三）治法治则 (31)
二、复方斑蝥胶囊的抗肿瘤研究 (31)
（一）复方斑蝥胶囊 (31)
（二）复方斑蝥胶囊抗肿瘤作用的实验研究 (31)
（三）复方斑蝥胶囊抗肿瘤的临床研究 (32)
三、临床研究结果分析 (32)
结 语 (34)
参考文献 (35)
综 述 (39)
附录 (43)
致 谢 (44)
引 言
骨髓增殖性疾病（myelo- proliferative disorders，MPD），是一组克隆性造血干细胞的疾病，表现为一系或多系分化相对成熟的骨髓细胞不断的克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称。

临床上有一种或多种血细胞的质和量的异常、脾脏大、具有出血倾向、血栓形成及髓外化生等。

此疾病病程漫长，虽然MPN的发现已有接近百年的历史，但是在一般的情况之下，我们还是找不到是什么原因刺激骨髓血细胞大量的增殖。

2008年WHO[1]将骨髓增殖性疾病（myelo- proliferative disorders，MPD）更名为骨髓增殖性肿瘤（myelo- proliferative neoplasm，MPN）。

并且明确的强调，这一疾病的本质是肿瘤。

新分类的MPN包括原发性血小板增多症（essential thrombocythaemia，ET），真性红细胞增多症（polycythaemia vera，PV），特发性骨髓纤维化（idiopathic myelofibrosis，IMF），慢性粒细胞性白血病（chronic myelocytic leukemia，CML），慢性中性粒细胞白血病（chronic neutrophil leukemia，CNL），慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸细胞综合症（chronic acidophilicgranulocyte leukemia/hypereosinophilic Syndrome，CEL/HES），肥大细胞病（mast cell disease，MCD）等多种疾病。

其中CML的发病机制目前已经得到公认，染色体t（9；22）（q34；q11）形成Ph染色体，Ph染色体是CML的特征性的遗传学的异常的标志，而染色体异位产生的融合基因BCR-ABL为CML的特有的分子生物学和细胞遗传学的标志。

而PV、IMF、ET等MPN的发病机制一直未得到阐明，一直期待能有一项像CML的Ph染色体和融合基因的特征性的标志的出现。

直到2005年发表在Nature上的一篇文章首次报道了多种MPN均存在JAK2基因的突变。

并报道，在他们的研究中发现了JAK2基因的突变，而且JAK2基因的突变导致基因编码产物的第617位氨基酸由缬氨酸（V）突变为苯丙氨酸（F）[2]。

这一变化导致JAK激酶相关的特异性的受体酪氨酸磷酸化活性持续增强，使红细胞对细胞因子如EPO的反应增强，持续激活JKA-STAT信号途径，从而发生PV，这一机制在小鼠的模型中得到证实。

并且大量的实验研究资料显示[3~7]，JAK2 V617F也存在于其他MPN中。

目前，学者认为MPN患者体内存在着JAK2基因突变，在启动MPN的发生和发展中起着关键性的作用。

有无JAK2突变成为MPN 的主要诊断指标。

对于该病，目前尚无特效的治疗方法，对于ET、PV、IMF，羟基脲、干扰素和化
疗药物是目前MPN的主要治疗手段，主要目的是减少肿瘤的负荷、非特异性的抑制肿瘤的增长，改善临床症状，预防转为急性白血病，但大多数患者只能获得短暂缓解，效果大都不太理想，预后较差，最终因耐药而复发或转为急性白血病。

因此，研究有效的靶向治疗的药物显得越来越重要。

长期以来，因为缺乏比较确切的诊断方法，我们在IMF、PV、ET的诊断上有很多的不足。

JAK2基因突变的发现对IMF、PV、ET等MPN的发病机制有了突破性的认识，并且随着对MPN的发病机制的逐步探讨的深入，为我们提供了一个新的治疗思路和方法。

并且国外研究[8,9]发现，人类JAK2基因突变阳性的MPN患者，在其发病时外周血小板计数明显的低于JAK2基因突变阴性的MPN 患者。

中医学中无骨髓增殖性疾病这一病名，现我们主要将MPN归于“髓劳”、“血瘀”、“血证”、“血实”、“癥瘕”等范畴，其对MPN的现代研究从60年代开始，经过几十年的基础及临床研究，中医药、中西医结合在治疗MPN方面取得了显著的成就。

在MPN治疗中，中药可减轻西药治疗过程中的各种毒副反应，预防疾病的复发，延长其缓解期，抑制肿瘤细胞的增殖，诱导肿瘤细胞的凋亡等作用。

斑蝥为昆虫纲，鞘翅目，芫菁科，南方大斑蝥（Mylabris phalcrata pallas）或黄黑小斑蝥(Mylabris cichorii linnacus)的干燥体。

中医学认为，斑蝥辛热，有大毒，归肝、肾、胃、小肠、大肠经。

具有破血散结，逐瘀消癥，攻毒蚀疮等治疗作用。

斑蝥素是中医药治疗血液系统肿瘤的常用药物之一。

经过研究证实，斑蝥素（Cantharidin，CTD）为斑蝥的主要活性成分[10]。

斑蝥素具有诱导肿瘤细胞的凋亡、抑制肿瘤细胞的增殖、抑制肿瘤细胞的迁移、升高白细胞，提高机体免疫力等作用。

为了进一步研究中药提取物斑蝥素对MPN的治疗作用及其治疗MPN的作用机制，尤其是研究斑蝥素对MPN的作用是否与其下调JAK2突变基因的表达有关，我们以JAK2(V617F)阳性的人红白血病细胞株（HEL细胞株）作为研究对象，用中药提取物斑蝥素进行干预，镜下观察其对细胞增殖和凋亡的影响，并用RT-PCR半定量法检测斑蝥素对HEL细胞株JAK2基因的表达情况，设计了此实验。

以期为中药在治疗MPN 的研究方面提供新的思路。

复方斑蝥胶囊是临床上常用的抗癌中成药，由斑蝥、三棱、莪术等11味中药组成，具有破血遂瘀，行气散结，消肿止痛的作用。

其主要的抗癌成分为斑蝥。

临床证明，复方斑蝥胶囊对于肝癌的治疗有确切的疗效，但对MPN的治疗未见报道。

导师在
多年的临床治疗中发现，复方斑蝥胶囊对MPN的治疗有明显的疗效，应用复方斑蝥胶囊联合西药羟基脲和干扰素治疗MPN可起到减毒增效的临床效果。

本课题分为两部分。

第一部分为实验研究，本课题以JAK2(V617F)阳性的人红白血病细胞株（HEL细胞株）为研究对象，以中药提取物斑蝥素进行干预，通过细胞培养、MTT试验、PT-PCR观察斑蝥素对HEL细胞株增殖及诱导凋亡作用，进一步研究斑蝥素治疗MPN的作用机制，为临床应用斑蝥素治疗MPN患者提供理论依据。

第二部分为临床研究，以MPN患者为研究对象，观察复方斑蝥胶囊联合西药治疗对MPN患者的临床疗效，探讨复方斑蝥胶囊对MPN的治疗作用。

第一部分实验研究
斑蝥素对HEL细胞增殖及诱导凋亡作用及对JAK2基因表达的影响研究
一、主要仪器和材料
（一）主要仪器
1．BB16 CO2培养箱（德国Hreaeus）；
2．MDF-382E型-80℃超低温冰箱（日本三洋柱式会社）；
3．25-2型低速自动平衡离心机（北京医用离心机厂）；
4．蒸汽压力灭菌器（山东新华安得医疗用品有限公司）；
5．恒温水浴箱（北京医疗设备厂）；
6．Megafuge 1.0R水平低温高速离心机（德国Hreaeus）；
7．倒置相差显微镜（Olympus）；
8．UV 1601分光光度计（日本Shimadzu公司）；
9．HF-safe-1200型生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；
10．电子PH计（DELTA）；
11．超净工作台（HEAL FORCE）；
12．普通冰箱（海尔集团）；
13．GIS-2008数码凝胶图像分析处理系统（上海天能科技有限公司）；
14．PCR扩增仪（美国Applied Cybernetics）；
15．DYY-Ⅲ2型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；
（二）主要试剂
1．细胞培养试剂
RPMI-1640培养液（美国HyClone公司）；
胎牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司）；
磷酸盐缓冲液(PBS)（北京中杉生物有限公司）；
二甲基亚砜（DMSO）（美国sigma）。

2．MTT试剂
MTT粉（美国Sigma）。

3．细胞染色试剂
瑞士-吉姆萨染液（美国Sigma）。

4．RNA提取试剂
DEPC（焦磷酸二乙酯）水（美国Sigma）；
Trizol试剂 （美国Invitrgen）；
氯仿（三氯甲烷）（莱阳市康德化工有限公司）；
无水乙醇（莱阳市康德化工有限公司）；
异丙醇（天津市广成化学试剂有限公司）。

5．逆转录－聚合酶链反应（RT-PCR）试剂
TransScript TM One-Step RT-PCR SuperMix（北京全式金生物技术有限公司）。

6．电泳试剂
Tris（北京天根生化科技有限公司）；
核酸染料GeneFinder．EDTA（北京天根生化科技有限公司）；
10xDNA 电泳Loading Buffer（北京天根生化科技有限公司）；
琼脂糖（大连TAKARA）。

7．引物
JAK2 、β-actin基因引物，引物参考文献[11] 。

（上海生工生物工程技术有限公司合成）
PrimerName Sequence(5’ to 3’)
Product
Size (bp)
Tm
(°C)
JAK2
F: CAGCAAGTATGATGAGCAAGCTTT
R: CCAGAATATTCTCGTCTCCACTGAA
83 55
beta-actin F:AGCGAGCATCCCCCAAAGTT
R:GGGCACGAAGGCTCATCATT
265 54
8．细胞株
HEL细胞株（山东大学齐鲁医院肿瘤中心中心实验室赠）。

9．实验药物
斑蝥素（美国Sigma）。

（三）主要耗材
96孔细胞培养板（美国Costar公司）；
0.22um一次性过滤器（美国Life Sciences）；
25cm2培养瓶（美国Costar公司）；
1.5ml细胞冻存管（美国Costar公司）；
200μl和1000μlRNase-free枪头（Axygen）。

二、主要试剂配制
1．RPMI-1640培养基配制：成品RPMI-1640培养液，培养细胞时加入经56℃、30 min灭活的胎牛血清，调整其体积比为10％～20%，4℃备用。

2．PBS缓冲液的配制：取1L装PBS干粉完全溶解于1L的双蒸水中，PH计调整其PH值在7.2～7.4范围内，然后分装，放置蒸汽压力灭菌器中高压灭菌，置-20℃中贮存，4℃备用。

3．MTT溶液：0.25gMTT粉溶于PH在7.2～7.4，0.01mol/L的PBS缓冲液50ml 中，轻轻吹打至MTT粉全部溶解，0.22um一次性过滤器过滤除菌，-20℃避光保存，置于4℃避光备用，并于两周之内使用。

4．冻存液配制：以RPMI-1640培养基：DMSO=9：1比例配制，置于4℃备用。

5．电泳缓冲液的配制（5×）：取Tris 54 g，Boric acid 27.5 g，0.5 M EDTA (pH 7.9)
20 ml ，加蒸馏水至1000 ml，充分搅拌均匀，室温保存。

三、实验过程
（一）细胞培养
1．细胞复苏：
提前将水浴箱预热至39℃。

然后从液氮罐中取出细胞冻存管。

迅速将冻存管放入39℃水浴中，并轻微晃动，尽快使其完全融化（此间，防止水浴箱中的水进入冻存管中）。

待细胞株溶化后，从水浴箱中取出，用酒精棉球消毒冻存管，于无菌操作台中取出细胞悬液移至离心管中，1000rpm离心5min。

弃去上层冻存液。

向离心管中加入4ml完全培养基并轻轻吹打混匀。

后接种于25ml培养瓶中，酒精棉球消毒后置于37℃培养箱中培养，过夜。

次日观察细胞状态，若培养液颜色变黄时即更换培养液。

待细胞生长良好至对数生长期时，进行细胞传代培养。

2．细胞冻存：
取生长状态良好，处于对数生长期的细胞。

用无菌吸管缓慢吹打均匀，转移至离心管中，1000rpm离心5min，弃上清。

加入冻存液，计数板计数，并调整细胞浓度至15×106/ml～1×107/ml。

每个冻存管加1ml用冻存液悬浮的细胞。

梯度降温：4℃
30min，-20℃30min到2h，-80℃过夜，液氮保存。

3．细胞传代培养：
将复苏成功的细胞，按0.5~1×106/瓶的密度接种于含1640培养液（含10%胎牛血清）的无菌培养瓶中，37℃培养箱中培养。

待细胞培养液颜色变黄时(一般1-2d)，于超净工作台更换一次培养液；并根据倒置显微镜观察结果，及时传代，一般2-3d 传代一次。

取生长良好处于对数生长期的细胞进行实验。

（二）生长抑制率测定（MTT实验）
1．选取生长状态良好，处于对数生长期的HEL细胞，用含10%胎牛血清的RPMI1640培养液配成单个细胞悬液，计数板计数，调整细胞浓度为每孔5×104个，加到2块96孔培养板中。

2．设阴性对照孔（不加药物）5个，调零孔（只加完全培养基）5个，实验孔25个，在实验孔内分别加入终浓度为5mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、80 mg/L 的斑蝥素溶液，每个浓度设置5个复孔，每个孔终体积为180ul。

3．将培养板移入CO2培养箱中，在37℃、5% CO2及饱和湿度条件下，分别继续培养24小时、48小时。

4．24小时、48小时后分别取出1板，每孔加入5mg/ml的MTT 20ul/孔，继续培养4小时后，1700r/min离心9min，小心吸弃上层培养基，加入浓度为5%的DMSO 200ul/孔，低速震荡器震荡15min，使培养板底部的结晶物充分溶解。

5．以630nm为参考波长，以490nm为测量波长，在酶联免疫检测仪上测定每个孔的光吸收值（即OD值），并记录检测结果。

6．根据酶标仪的检测结果，计算细胞生长抑制率和存活率
细胞生长抑制率和存活率计算公式如下：
细胞抑制率=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%
细胞存活率=实验组OD值/对照组OD值×100%
用细胞存活率对剂量对数作图，并按以下公式求出IC
50
值：
IC
50=lg-1[X
m
-I(P
∑-0.5)]
其中X
m =最大剂量对数值，P=细胞抑制率（用小数表示），P
∑=各组细胞抑制率
总和，I=相邻两组剂量比值的对数（高剂量做分子）
四、RT-PCR法检测JAK2基因的表达
（一）加药
培养瓶培养细胞，设对照组、斑蝥素20uM组、斑蝥素40uM组、斑蝥素80uM组，每组设3瓶，加药后继续培养24h、48h。

（二）细胞总RNA提取
1．细胞离心后，尽量彻底的吸去上清，取约1×107细胞，加入1ml Trizol，颠倒混匀10次，室温放置5min。

2．加入氯仿200μl（即总体积的1/5），颠倒混匀15次，室温放置5min。

3．4℃ 12000g离心15min。

4．取上清液400～500μl于另一EP管中。

5．加入等体积的异丙醇，颠倒混匀，室温放置10min。

6．4℃ 12000g离心10min，弃上清（小心弃掉，最后的一点可用枪头洗掉）。

7．加已放置-20℃的无水乙醇1ml。

8．4℃ 7500g离心5min，去上清，超净工作台干燥20～30min。

9．加DEPC水至20μl溶解混匀，置于-80℃冰箱保存待用。

（三）总RNA含量的测定（紫外分光光度计）
测定样品在260nm和280nm的吸收值用以确定RNA的质量，RNA的浓度计算公式：
1OD
260=40ugRNA。

对于测定的OD
260/280
在1.8～2.0的标本，说明提取的RNA纯度很高。

（四）RT-PCR一步法反应
一步法试剂盒中，需用经过灭菌的Rnase PCR管和枪头，注意每加一种试剂换一个枪头。

1．按下列组成配制RT-PCR一步法反应液
试剂 50ul反应体系 终浓度 5xOneStepRT-PCR Buffer 10ul 1x
Forward Primer,10ul 2ul 0.4uM
Reverse Primer,10ul 2ul 0.4uM OneStepRT-PCR EnzymeMix 1ul
RNA Template Xug 1ug RNase-Free Water up to 50ul
2．涡旋，瞬间离心。

3．将PCR小管放入PCR仪中，调整PCR仪的参数如下
JAK2 mRNA
45℃ 30min
95℃ 1min
94℃ 30S
60℃ 30S
72℃ 30S
35循环
72℃ 5min
4℃ 保存
β-actin
45℃ 30min
94℃ 5min
94℃ 30S
54℃ 30S
72℃ 45S
35循环
72℃ 10min
4℃ 保存
4．反应结束后，取10μl的PCR反应液进行琼脂糖凝胶电泳，确认PCR反应产物。

5．DNA电泳，操作步骤如下：
(1)制备0.5×TBE电泳缓冲液：取5×电泳缓冲液10ml，用蒸馏水稀释为0.5×，备用。

(2)制备琼脂糖凝胶：取0.5×TBE电泳缓冲液30ml与0.6g琼脂糖配制成2％琼脂糖凝胶，置于电磁炉内水浴加热熔化，待其冷却至65℃左右，加入DNA染色剂3μl 混匀，迅速倒入已封好的电泳槽内，并迅速插入梳子。

(3)40min左右，凝胶固化后，拔掉梳子，除去电泳槽两侧封带，将制备好的凝
胶移至电泳仪中，于电泳槽中加入足量的0.5×电泳缓冲液至完全覆盖过凝胶平面。

(4)取DNA扩增产物（每个标本5μl）与载样液（1μl）混合后，按顺序依次加到胶上的孔中，同时在加完样品的之后的一个孔中加入5μl的DNA Marker用作分子标志。

(5)120V电泳40分钟。

6．电泳后，在凝胶成像系统分析仪下摄片，结果用gel-pro软件分析，比值X=样品特异基因的PCR扩增反应产物灰度值/该样品的PCR扩增反应产物灰度值，表示样品特异基因mRNA的相对表达水平。

五、统计学分析
全部数据采用SPSS 16.0统计软件进行分析。

有关检验给出的检验统计量及其对应的P值，用双侧检验，以P<0.05为有统计学意义。

所有计量资料用均数±标准差(X±s)表示，正态分布资料采用t检验，非正态分布资料采用秩和检验。

六、实验结果
（一）细胞增殖能力检测（MTT实验）
应用MTT实验检测细胞增殖水平，不同浓度斑蝥素作用24h、48h后对HEL细胞株均具有抑制作用，且呈现剂量依赖性及时间依赖性，即斑蝥素高浓度组抑制率高于低浓度组，同浓度下48h组抑制率高于24h组抑制率。

不同浓度斑蝥素对HEL细胞的抑制作用
24小时 48小时
组别
OD值 抑制率（%） OD值 抑制率（%） 对照组 0.95±0.22 - 0.84±0.21 - 斑蝥素5µmol/L 0.85±0.42 10.15 0.65±0.04 22.14
斑蝥素10µmol/L 0.83±0.09 12.69 0.62±0.04 26.19
斑蝥素20µmol/L 0.82±0.36 13.32 0.54±0.05 35.24
斑蝥素40µmol/L 0.81±0.06 14.38 0.52±0.07 37.58
斑蝥素60µmol/L 0.79±0.42 16.91 0.49±0.03 41.90
细胞存活率=（实验组OD值/对照组OD值）×100%
（二）加药培养24h 、48h 后观察细胞形态
加入不同浓度的斑蝥素后，在相差倒置显微镜下观察见HEL 细胞株明显皱缩、死亡，细胞密度减少，见下图：
对照组（0h） 对照组（24h） 对照组（48h）
20uM 组（0h） 20uM 组（24h） 20uM 组（48h）
40uM组（0h） 40uM组（24h） 40uM组（48h）
80uM组（0h） 80uM组（24h） 80uM组（48h） （三）RT-PCR半定量检测JAK2基因表达情况
将标本用gel-pro软件分析，比值X=样品特异基因的PCR扩增反应产物灰度值/该样品的PCR扩增反应产物灰度值，表示样品特异基因mRNA的表达水平。

1．采用RT-PCR法检测HEL细胞株JAK2基因的mRNA半定量表达结果，见下图：
M A0 A1 A2 A3 B0 B1 B2 B3
M是Marker,A0是空白组JAK2mRNA，A1是20uM组JAK2mRNA，A2是40uM组JAK2mRNA，A3
是80uM组JAK2mRNA；B0是对照组β-actin，B1是20uM组β-actin，B2是40uM组β-actin，B3是80uM 组β-actin。

2．RT-PCR半定量检测JAK2基因mRNA表达水平
各组JAK2基因 mRNA表达水平比较（x±s）
基因 空白组 20uM组 40uM组 80uM组 JAK2 0.764±0.039△0.526±0.035 0.365±0.024 0.124±0.013 两两比较，*p<0.01
讨 论
一、JAK2基因突变在骨髓增殖性疾病中的重要作用
骨髓增殖性疾病（myelo- proliferative disorders，MPD），是一组克隆性造血干细胞的疾病，表现为一系或多系分化相对成熟的骨髓细胞（包括红系、粒系以及巨核系）不断的克隆性增殖所致的一组肿瘤性疾病的统称，其特点是骨髓增殖的细胞可向中末分化成熟不伴有发育的异常，骨髓有核细胞明显增多。

临床上有一种或多种的血细胞的质和量的异常、外周器官浸润、肝脏及脾脏可见肿大、具有出血倾向、血栓形成及髓外化生等。

此疾病病程漫长，虽然MPN的发现已有接近百年的历史，但是在一般的情况之下，我们还是找不到是什么原因刺激骨髓血细胞大量的增殖。

2008年WHO[1]将骨髓增殖性疾病（myelo- proliferative disorders，MPD）更名为骨髓增殖性肿瘤（myelo- proliferative neoplasm，MPN）。

并且明确的强调，这一疾病的本质是肿瘤。

新分类的MPN包括原发性血小板增多症（essential thrombocythaemia，ET），真性红细胞增多症（polycythaemia vera，PV），特发性骨髓纤维化（idiopathic myelofibrosis，IMF），慢性粒细胞性白血病（chronic myelocytic leukemia，CML），慢性中性粒细胞白血病（chronic neutrophil leukemia，CNL），慢性嗜酸细胞白血病/高嗜酸细胞综合症（chronic acidophilicgranulocyte leukemia/hypereosinophilic Syndrome，CEL/HES），肥大细胞病（mast cell disease，MCD）等多种疾病。

MPN的病因和发病机制，目前尚未完全明确。

2005年发表在Nature上的一篇文章首次报道了多种MPN均存在JAK2基因的突变。

在他们的研究中发现JAK2基因突变，导致基因编码产物的第617位氨基酸由缬氨酸突变为苯丙氨酸[2]。

这一变化导致JAK激酶相关的特异性的受体酪氨酸磷酸化活性持续增强，使红细胞对细胞因子如EPO的反应增强，持续激活JKA-STAT 信号途径，从而发生PV，这一机制在小鼠的模型中得到证实。

同样的，JAK2 V617F 也存在于其他MPN中[2]。

并且大量的实验研究资料显示[3~7]，目前，学者认为MPN 患者体内存在着JAK2基因突变，在启动MPN的发生和发展中起着关键性的作用。

有无JAK2突变成为MPD的主要诊断指标。

二、HEL细胞株对MPN的研究的意义
Joanna.E等研究近二百种细胞株，发现只有HEL细胞系存在着JAK2 V617F的突变。

我们以HEL细胞系为研究对象，可以观察药物对JAK2基因表达的影响，为
研究针对JAK2基因的靶向治疗的药物提供条件。

三、中医学对MPN的认识
中医学无骨髓增殖性疾病或者是骨髓增殖性肿瘤的病名的记载。

本病起病隐袭，变症多端，进展缓慢，病程长。

MPN属中医学“血证”、“虚劳”、“症瘕”、“血瘀”、“积证”、“瘀血”、“毒热”等的范畴。

MPN的主要临床表现为：瘀血、血虚、血热、正虚、出血。

（一）病因
宋代陈无择《三因极一病证方论》中认为:“凡治病，先须识因；不知其因，病源无目。

”中医学认为致病因素不外乎内因和外因这两个部分。

导师根据多年的临床经验，认为本病的病因应是以内因为主。

外因有六淫、疫厉毒气；内因有先天禀赋不足、饮食失洁、劳逸损伤、七情所伤等。

六淫的致病与气候节令密切相关，起病较快；疫厉毒气致病传染性强，发病急剧。

MPN患者起病大多缓慢、隐匿，没有明显的外部因素的干预，并且病程长，因此，我们认为其病因是以内因为主，外因是本病复发、加重的诱因。

先天不足、后天失养是本病的主要病因：肾为先天之本，主骨生髓。

肾之阴精不足，相火妄动，而致骨髓生化异常，在外因诱发的作用下导致骨髓异常增殖而发为本病。

（二）病机
病机为本虚标实。

以肝肾亏虚、阴阳失横为本，血瘀、痰毒互结为标。

《黄帝内经素问》指出:“肾主骨、生髓、藏精”,“骨髓坚固，气血皆从”，“骨者髓之府”。

骨髓组织持续过度增殖，从而导致正常造血功能失调发为本病。

因此我们认为肾脏与本病的关系密切。

肾阴、肾阳协调平衡维持肾脏功能的稳定，同时维持正常造血。

若肾阳衰微，不能温化阴精，化生血液失常，则会出现血虚；若肾阴不足，无以制阳，可致相火妄动，影响骨髓的正常造血功能，造血紊乱，出现病态造血，甚或进一步煎熬真阴，最终导致骨髓造血机能衰竭。

MPN患者，特别是PV患者，血瘀表现明显。

主要表现为：皮肤及粘膜紫暗，鼻衄齿衄，皮下瘀斑瘀点，舌质暗、脉涩。

并且易于瘀阻脑脉，可致中风不仁；或者瘀阻心脉，致胸痹心痛；瘀阻经脉，导致脉痹水肿；瘀阻手足，导致指趾青紫疼痛，甚则导致坏疽等。