酶--膜法提取纯化荔枝核中氨基酸

酶--膜法提取纯化荔枝核中氨基酸
荔枝核是我国传统中药，药典记载荔枝核能祛寒止痛，归肝肾经，现代临床研究发现荔枝核水提液能够有效降低血糖、调节血脂、提高抗氧化能力、抑制乙肝病毒表面抗原(H BsAg)。

i荔枝核中含有多种人体必须氨基酸，具有提高人体免疫力，养颜美容等功效，其中(a-亚甲环丙基)甘氨酸己被证实能够降低血糖和肝糖原，可用于治疗糖尿病。

目前除少量药用外，大量荔枝核被废弃，研究开发荔枝核中氨基酸的提取工艺，实现荔枝核综合利用很有意义。

提取氨基酸的传统方法有水提法、酸或碱解提取法，近年来酶解辅助提取法应用越来越广泛。

酶法辅助提取天然植物有效成分，具有提取条件温和、提取率高、环境友好等优点，是一种高效环保的工艺。

日前酶解提取液的纯化工艺多采用醇沉、絮凝、离心、萃取等方法，工艺复杂，能耗大成本高，回收率不高。

膜分离技术是以选择性透过膜为介质，在体系侧施加压力，通过膜孔的筛分、吸附等作用使体系中的不同组分选择性透过，从而实现分子水平上的分离纯化和浓缩。

膜分离工艺流程短、操作简单、能耗低、有效成分损失少，能够改善传统工艺的不足，在中药制剂和天然产物分离纯化过程中，引起业内人士广泛兴趣。

本文用酶法与陶瓷膜超滤相结合的工艺，提取纯化分离荔枝核中的氨基酸，取得了很好的效果，工艺简单、经济高效、绿色环保。

1 材料与方法
1.1材料
荔枝核，谷氨酸，水合茚三酮，牛血清蛋白，考马氏亮蓝G-250，葡萄糖，XJT9503中性蛋白酶等试剂，均为AR。

1.2仪器
756MC紫外-可见光分光光度计，Exp lorer电了天平，PHS-3C精密PH计, DT多功能提取罐,陶瓷膜小试设备,陶瓷超滤膜(截留相对分子质量M w co =1.5万，5万，15万，30万)。

1.3样品的;则定
1.3 1氨基酸的测定
氨基酸测定以谷氨酸为标准品，用茚三酮显色的分光光度法。

样品溶液加两倍体积量的乙醇静置充分沉淀，离心，取上清液浓缩除掉乙醇，浓缩液显色测定吸光度，计算出样品中氨基酸的含量。

L32蛋白质的测定
蛋白质测定以牛血清蛋白为标准品，用考马氏亮蓝显色的分光光度法。

L33多糖的测定
多糖=总糖一还原糖;总糖用苯酚-硫酸法测定，以葡萄糖为标准品，还原糖用3，5-二硝基水杨酸比色法测定。

L4实验方法
L41酶解提取
荔枝核打成粉，过40目筛。

称取荔枝核粉5g加入25 mL水和一定量的蛋白酶，混匀后在一定温度下酶解。

酶解完成后再加入50 mL水，升温至90℃提取1h过滤提取液，测定氨基酸的得率。

考察酶用量、酶解温度、酸碱度、酶解时间等因素对酶解提取效果的影响。

酶的用量按每克荔枝核粉所添加的酶活单位计。

酶解提取扩大实验:称取荔枝核粉5 kg按确定的酶解提取优化条件在DT多功能提取罐中提取，提取液粗滤后即为待纯化的酶解料液，测定氨基酸的得率。

氨基酸得率=(酶解提取液中氨基酸的质量/荔枝核粉的质量)x 100%
L42陶瓷膜超滤纯化
酶解提取扩大实验所得的酶解料液，用不同截留相对分了质量的超滤陶瓷膜超滤纯化按式(1)测定膜通量J;测定提取液和透过液中多糖、蛋白质、氨基酸的含量，按式(2)计算出截
流率R。

综合考虑膜通量和截流率的结果，筛选出最适合的膜，考察操作压力料液温度对超滤纯化的影响，确定超滤纯化的优化条件。

膜通量、截流率的计算式如下:
21酶解提取
2 L 1酶用量对氨基酸得率的影响
图1证明，使用蛋白酶酶解荔枝核后氨基酸的得率大大提高。

其他条件相同，未使用酶处理时氨基酸得率仅为0.24% ,随着酶用量的增加，氨基酸
得率不断提高。

当酶用量为600 U/g时，氨基酸得率达到1.12%;;继续增加酶的用量，氨基酸得率增加趋缓。

用蛋白酶酶解荔枝核可以提高氨基酸的得率，蛋白酶的用量宜取600 U/g。

2 L 2酶解温度对氨基酸得率的影响
酶解作用受温度影响很大。

实验考察了酶解温度对氨基酸得率的影响，结果见图2。

可以看出，随着酶解温度提高，氨基酸得率逐渐增加，在50℃时达到最高，继续提高温度得率开始下降，温度达到65℃后得率与不加酶的实验接近，表明酶解温度在65℃以上蛋白酶己基本失活。

因此，选择适合的酶解温度为50℃。

2 L
3 PH对氨基酸得率的影响
实验考察了酶解时，PH=5.5-8.0对氨基酸得率的影响，结果见图3.可以看出，当PH= 6.5时效果最好，蛋白酶的酶活力最大，PH太高或太低均会抑制酶的活力，因此，确定酶解的PH= 6.5。

2 L 4酶解时间对氨基酸得率的影响
在酶用量为600 U/g酶解温度50℃，PH=6.5条件下进行实验，可以看出，随着酶解时间延长，氨基酸得率逐渐增加，酶解90m in时氨基酸得率为1.16%,继续延长酶解时间，氨基酸得率提高不大，因止,选择酶解时间为90 min 。

使用蛋白酶酶解提取荔枝核氨基酸，一方面蛋白酶能够水解荔枝核中蛋白质，转化为所需的氨基酸，另一方面蛋白酶对植物细胞壁有一定的破壁作用，有利于氨基酸的浸出。

通过以上实验，确定荔枝核氨基酸酶解提取的优化工艺为:蛋白酶的用量600 U/g，酶解温度50 ，PH= 6.5,酶解时间90min，氨基酸得率为1.16%。

不加酶提取氨基酸的得率仅为0.24%，表明酶解过程有助于提高氨基酸得率。

称取荔枝核粉5kg按优化确定的酶解提取方法和条件，在DT多功能提取罐中进行酶解提取扩大实验，5次平行实验测定氨基酸得率在1. 2%-1.07%，表明本酶解提取工艺优化条件能够用于放大生产，氨基酸得率保持稳定。

2 L 5酶解提取工艺与其他提取工艺的比较
分别采用水提工艺和酸解提取工艺提取荔枝核氨基酸。

5g荔枝核中加入75 mL水，恒温90℃提取150 min,测定氨基酸得率为0. 41%。

5g荔枝核中加入75 mL水，调节PH=1,恒温90℃酸解提取150min,氨基酸得率为0.92%。

比较上述3种工艺的实验结果可以看出，酶解提取工艺能够提高氨基酸的得率，同时避免了酸性溶液对设备的腐蚀，减少了环境污染。

2 2超滤膜分离纯化
2 2 1超滤膜的选择
分别选取截留相对分子质量为30万、15万、5万、1.5万的陶瓷超滤膜，在一定的操作压力和料液温度下，对酶解料液进行超滤纯化1h测量超滤膜的平均膜通量和各组分的截留率，结果见表1
超滤前酶解料液为棕黄色浑浊液，陶瓷膜超滤的透过液为黄色澄清溶液，表明超滤膜对料液中悬浮物有很好的截留效果。

从表1中可以看出，随着超滤膜的截留相对分子质量增大，膜通量相应增加，但截留相对分了质量为30万、15万、5万的超滤膜的通量相差不大，对氨基酸均具有很好的透过性，截留率低;但大分子组分如蛋白质和多糖等在截留相对分子质量为30万、15万的超滤膜上的透过率也比较高，难以有效去除，综合考虑膜通量和各组分的截留率，选择截留相对分子质量5万的超滤膜用于荔枝核酶解料液的纯化分离。

2 2 2操作压力对超滤纯化结果的影响
超滤膜两侧的压力差是实现超滤的推动力，对料液各组分的渗透有决定性的影响。

在料液温度为30℃条件下，考察了操作压力对膜通量和截留率的影响。

见图5。

从图5可以看出，随着操作压力的增加，初始膜通量相应增加，随着超滤时间延长，膜污染越来越严重，膜通量均逐渐下降。

但操作压力大时，膜表面的组分浓度变化大，由此引起的浓差极化和膜污染更严重，膜通量下降更快。

表2为不同压力下的平均膜通量和各组分的截留率。

操作压力增大，平均膜通量增加，氨基酸截留率下降，透过率增大，蛋白质截留率变化不大，多糖截留率略有下降，但仍大于85%。

高操作压力下，膜通量大大提高，透过液中氨基酸的浓度下降，氨基酸的截留率有所下降，有利于氨基酸和多糖、蛋白质等大分子的分离纯化。

但是操作压力过高，会使膜不可逆污染严重，因此，选用本实验设备允许的最高操作压力0.22MPa。

2 2 3料液温度对超滤纯化结果的影响
料液温度对超滤膜通量和截留率有一定影响。

在操作压力0.22MPa条件下，考察了料液温度对膜通量和截留率的影响，结果见图6、表3。

图6表明，料液温度越高，初始膜通量越大，但料液温度大于35C后，膜的浓差极化和膜污染严重，膜通量下降很快。

表3表明，料液温度提高，平均膜通量和氨基酸的截留率变化不大，多糖和蛋白质的截留率有所下降。

温度升高，分了运动加速，料液粘度下降，传质系数提高，有利于分子的渗透，初始膜通量会相应提高，但是温度升高会加剧膜污染，膜通量下降更快，所以料液温度变化对膜的平均膜通量影响不明显。

随着温度升高，大分子如多糖、蛋白质等也容易通过，截留率会相应降低。

30℃时氨基酸的截留率仅为10.3%，蛋白质截留率为98. 1%，多糖的截留率为85.2%，氨基酸与蛋白质、多糖能够有效分离，同时膜通量变化比较平缓，膜污染较轻，综合考虑膜通量和截留率，选择超滤的料液温度为30℃。

超滤结束后需对膜进行清洗和再生。

采用化学法清洗膜，先用热水循环洗30 min再依次用、w( Na0H)=0.5%的水溶液循环洗30min w (NaClO)==0.2%的水溶液循环洗30 min 1 mo1/L 的盐酸溶液循环洗30 min最后用清水循环洗30min可以很好地清除膜的污染，恢复膜的通量。

3结论
蛋白酶解提取荔枝核中氨基酸能够提高氨基酸得率。

在其他条件相同的情况下，未使用酶处理提取荔枝核中氨基酸得率仅为0.24%，使用XJT9503中性蛋白酶，按照酶用量600 U/g 酶解温度50℃，PH=6.5酶解90 m in的优化工艺酶解后再提取，氨基酸得率达到1.16%。

放大实验结果显示，本工艺能够用于扩大生产，氨基酸得率稳定在1. 20%-1.07%。

采用常规水提法氨基酸得率仅为0. 41%，酸解提取法氨基酸得率为0. 92%，实验结果表明，采用酶解提取法提取氨基酸后，得率有较大提高，同时能够避免酸性溶液对设备的腐蚀，减少了对环境的污染，高效环保。

使用截留相对分子质量为5万的陶瓷膜对酶解提取液进行分离纯化在操作压力0. 22 M
Pa和料液温度30℃条件下超滤，膜的平均通量为75. 63 L /m2.h，氨基酸截留率仅为10.3%，蛋白质截留率高达98. 1%，多糖截留率为85.2%，有效地实现了氨基酸与蛋白质、多糖等大分子的分离和纯化。

采用超滤法分离氨基酸与蛋白质、多糖等大分子，与传统的醇沉、絮凝、离心、萃取工艺相比，不添加有机醇和絮凝剂，有效成分不会由于共沉淀而损失，操作简单，对环境污染小。

酶--膜法提取纯化荔枝核中氨基酸工艺是一种高效、绿色、环保的工艺。