结核分枝杆菌的核酸检测PPT课件

DNA扩增技术检测有哪些不足
• 相比DNA检测技术，RNA检测更适合判断病原体转录活性，DNA检测技术 不能判断病原体转录活性，不能区分潜伏感染和活动性感染（活动性感染： 指示RNA转录活跃，潜伏感染：指示RNA不转录）
• 交叉污染问题 • 变温检测，对仪器要求高 • 抑制反应（Ta q酶）
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Xpert MTB/RIF
一种半巢式实时荧光PCR体外 诊断技术，可以检测结核分枝杆 菌以及利福平耐药性；
针对rpoB基因81bp利福平 耐药核心区间（RRDR）设计引物、 探针。5个探针结合到野生型，而 不是突变体目标。每个探针用不 同的荧光染料标记，允许同时检 测。
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痰标本与处理液 1：2混合
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• 3. 胃灌洗液 （1）婴幼儿、儿童和迟钝者诊断肺结核时，鉴于无法采集标本或支气管灌洗液，推 荐采集胃液标本，通过胃灌洗咽下去的痰液。 （2）标本应在采集4小时内送到实验室，否则应置于一次性内含100ml碳酸钠酸他 的无菌容器中。 （3)胃灌洗液需连续采集3天，体积5～10ml，调节pH至中性。
液、组织、脓肿物、吸出的脓液、创伤标本、大便标本 • 分枝杆菌分离培养：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体 液、组织、脓肿物、吸出的脓液、创伤标本、大便标本、血液 • 结核分枝杆菌的核酸检测：
痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体 液、组织、脓肿物、吸出的脓液、创伤标本、大便标本、血液（GeneXpert除 外）、病理切片
增加分子生物学阳性可以作为确诊标 准，及强调病原学检查的重要性。
3.4.2 分子生物学检查 结核分枝杆菌核酸检测阳性。 4 诊断原则 肺结核的诊断是以病原学（包括细菌学、 分子生物学）检查为主，结合流行病史、 临床表现、胸部影像、相关的辅助检查 及鉴别诊断等，进行综合分析做出诊断。 以病原学、病理学结果作为确诊依据。 5.3 确诊病例 结核分枝杆菌核酸检测阳性，及胸部影 像学检查支持即可确诊。
知模板进行定量分析的办法。
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目的基因片段 方法
时间 检测敏感度 优点Biblioteka 缺点Xpert MTB/RIF
rpoB 半巢式实时荧光PCR
TB-LAMP
gryB及IS6110 环介导恒温扩增
结核杆菌DNA
IS6110 实时荧光定量PCR
2小时
1小时
2.5小时
131菌条/ml
100菌条/ml
1000～10000菌条/ml
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样本类型（二）
• 分枝杆菌菌种鉴定 临床分枝杆菌分离培养物
• 结核分枝杆菌药物敏感性试验： 临床分离结核杆菌纯培养物
• 结核抗体的检测： 血清
• IFN-γ释放试验（T-SPOT.TB ）： 肝素锂或肝素钠抗凝血
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标本留取标准
• 1.痰标本： （1）可疑肺结核患者：初诊病人应收集3份标本（当日即时、夜间和次日晨痰），治疗中或随访病人应按期
• 结核分枝杆菌核酸检测是检测结核分枝杆菌特异的核酸序列； • 阳性结果提示该检测结核分枝杆菌核酸的存在，在排除核酸污染的情况下，可确定该检测标本中存在结核
分枝杆菌。 • 结核分枝杆菌核酸检测较常采用的目的片段有16SrRNA、IS6110、MBP64、rpoB、hsp65等
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结核分枝杆菌核酸检测
吸取2ml处理样品 到反应盒
系统内自动完成
标本自动 清洗过滤
超声裂解 DNA提纯
DNA和PCR反应 试剂混合
半巢式实时荧光 定量核酸扩增检
测
打印检 测报告
将反应盒放入检测模块 （手工操作完成）
获得检测结果时间：1小时50分钟
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MTB/RIF检测对MDR-TB的防控
“结核+利福平耐药”对多耐结核控制产生的效果最 为显著。即便补充异烟肼耐药，能提升的效果有限。
留取2份痰标本（晨痰、夜间痰），体积3～5ml，盛于广口和具有螺旋盖子的痰瓶中。 （2）即时痰采集后立即送检，夜间痰和晨痰采集后常温保存不应超过12小时，对当日不能进行涂片检查的标
本，须置于4℃冰箱保存，注意防止痰液干涸或污染。 （3）对无法咳痰的患者：可使用高渗盐水（3% NaCl）诱导痰或收集清晨胃液标本，或使用支气管镜采集支
• 4.尿液 （1）采集标本前，应清洗外生殖器，推荐连续采集3天清晨中段尿于无菌容器中，用 于培养的尿液标本至少需要40ml （2）只有在不能获得中段尿时，可以使用导尿术采集标本。 （3）标本运送不及时，应冷藏保存。
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• 5. 无菌采集的体液（脑脊液、胸水、腹水、心包积液、关节液、骨髓） （1）临床医生采用抽吸技术或外科操作无菌收集体液标本于无菌容器。 结 核 杆 菌 DNA 及 Xper t 标 本 ： 为 防 止 标 本 凝 固 ， 需 加 入 EDTA 抗 凝 处 理 （ 可 注入于长紫管中颠倒混匀抗凝处理）。 IF N- γ 释 放 试 验 （ T- SPOT.TB ） 标 本 ： 分 离 淋 巴 细 胞 需 加 入 肝 素 抗 凝 ， 抗 凝 比例为100ml胸腹水加入0.8ml肝素，颠倒混匀。 （2）标本尽可能快的运送到实验室 （3）应提交足够量的样本，脑脊液＞5ml，胸水和腹水5～10ml。
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• 7.血液 （1）如果血液标本接种培养基之前需要运输，肝素成柠檬酸盐可以用于抗凝。
E DTA 抗 凝 和 凝 固 的 血 不 能 做 培 养 。 （ 2 ） 血 液 和 脑 脊 液 标 本 培 养 推 使 且 M Y C O ／ F LY T I C 瓶 （ B D ） 血 培 养 瓶 。 （ 暂
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环介导等温扩增仪（TB-LAMP）
体外定性检测结核分枝杆菌复合群； 在恒温条件下进行基因扩增反应； 4种引物识别6个区域，特异性高； 扩增反应效率高，67℃，40min。 主要优点在于对实验室仪器的依赖程度较 小，而且试剂成本较低。
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传统实时荧光定量PCR检测
• 目的：定量检测人标本中的结核分枝杆菌核酸 • 原理：PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累计实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未
耐药结核 ✓当患者具有耐药结核的风险，或者合并HIV感染，或者病情严重 时，应使用Xpert MTB/RIF做初始诊断；
肺外结核 ✓所有患者，包括儿童，怀疑有肺外结核时，应当采集相应的样本 进行微生物学和组织学检查；优先推荐使用Xpert MTB/RIF 做初 始诊断
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GeneXpert
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感谢您的观看。
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气管灌洗液标本。
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• 2．支气管抽吸物、支气管肺泡灌洗标本、肺穿刺物、肺活检标本 （1）对于不能留取痰标本的患者：推荐使用侵入性采集技术获取标本，比如纤 维支气管镜检查、细针肺穿刺、肺活组织检查。 （2）严格器械清洁和消毒，避免引起交叉污染和感染。 （3）支气管镜不能接触自来水，通免污染环境分枝杆菌。 （4）对难以诊断的病例推荐使用其他侵入性技术采集标本，比如细针穿刺、开 放肺活组织检查，无菌条件下采集的经支气管活检和其他活检标本，运输过程中， 应加入0.5～1ml无菌的生理盐水。 （5）支气管分泌物至少2～5ml；支气管肺泡灌洗液至少20-50ml。
2. Xichao Ou et al. A feasibility study of Xpert MTB/RIF test at the peripheral level laboratory in China. International Journal of Infectious Diseases. 2015 (31):41-46.
1.假阳性率高 2.结合抗酸染色
荧光染色
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结核菌需要先培养出来（2-6周） 再加入不同浓度抗菌药物的培养基中继续培养4-8周报告药敏结果
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2014年WHO关于结核诊断的标准
肺结核 ✓所有患者，包括儿童，当疑似肺结核并可咳痰时，应送2份痰做 涂片镜检 或 1份痰做Xpert MTB/RIF检测 ✓对于涂阴疑似肺结核患者，应当使用Xpert MTB/RIF 或培养 进行 诊断
全自动、同时检测利福 67℃恒温扩增，扩增 适合大批量筛查，低费
平耐药基因、特异性高，时间短，特异性高，生 用
生物安全性高
物安全性高
最多一次同时检测八个 标本用量较少，除痰标 假阳性，易污染，需专
样本
本以外的标本需进一步 业人员操作
认证
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样本类型（一）
• 抗酸杆菌涂片镜检： 痰液、支气管灌洗液、支气管抽吸物、肺穿刺物、肺活检标本、胃灌洗液、体
免疫斑点干扰素释放试验
• 结核菌感染的免疫应答反应主要是细胞介导免疫反应； • T-SPOT.TB定量检测人外周抗凝全血中受结核杆菌特异混合多肽抗原（ ESAT- 6和CF P-10）刺激分泌细胞
因子干扰素的效应T淋巴细胞数量。 • 结核特异性抗原ESAT-6和CFP-10由结核杆菌基因组RD1区相同的操纵子编码的蛋白； • 所以的卡介苗菌株均丢失该基因序列 • 绝大多数环境分枝杆菌也不存在RD1区
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• 标本采集：肝素或柠檬酸钠抗凝的外周静脉血 • 分离单个核细胞，每个检测孔含有25万个细胞。每个检测标本分4个孔：空白对照，阳性对照，两个样本孔 • 37℃孵育16-20个小时 • 洗涤-抗体孵育1h-洗涤-显色-计数蓝色斑点 • 阴性结果：患者体内不存在结核杆菌特异的效应T细胞；排除结核感染（包括排除肺外结核感染） • 阳性结果：患者存在结核感染，但是不能区别是否为活动性结核病。
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常用技术
• 传统实时荧光定量PCR检测 • 半巢式全自动实时荧光定量PCR检测 • 环介导等温扩增检测 • 实时荧光核酸恒温扩增检测 • 交叉引物恒温扩增检测 • 基因探针检测
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抗酸染色
1.阳性率30% 2.无法区分TB or NTB
每张检查3-5min或更长时间→阳性率低因素之一
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• 6．无菌采集的组织（淋巴结、皮肤和其他活检标本） （1）采集标本尽可能无菌操作，放置到无固定剂或防腐剂的无菌容器中，不
能浸泡在盐水或其他液体或用纱布包裹，重量不少于1g。应迅速运送到实验 室，对于长时间的运输，为防止脱水可加入无菌盐水，保持温度在4～15℃ （2）针对皮肤溃疡，宜从病变组织周边采集活检标本。 （3）福尔马林溶液浸泡过的标本不能用于培养检查。 （4）极少量的活检标本可以浸泡在少量无菌盐溶液中。
时不做）
• 8.大便标本 大便标本涂片的敏感性只有32％～34％，不能根据涂片的结果决定是否进行 培养。
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• 9、病理组织切片（核酸检测） 在一只干净的离心管中加入6-12片5-10μm厚的FFPE，
勿切白片。 病理组织切片已固定，结核分枝杆菌已无活性，无法做培养。
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▪ INH单耐药的患者通常不会考虑立即改变治疗方案，与此相反，对RIF单耐药的 患者，无论INH是否耐药，都会采取与耐多药患者相同的治疗方案1。
▪ 约90%利福平耐药的结核患者同时异烟肼耐药，也就是耐多药结核患者2。
1. Sven O. Friedrich et al,. Suitability of Xpert MTB/RIF and Genotype MTBDRplus for Patient Selection for a Tuberculosis Clinical Trial. Journal of Clinical Microbiology. 2011 (49):2827-2831.