滴鼻感染铜绿假单胞菌致大鼠肺炎模型的评价

学术论著
[文章编号] 1672-8270(2019)06-0149-04 [中图分类号] R-332 [文献标识码] A
Evaluation on rat pneumonia model from PA infection by intranasal inoculation/DING Jun-ying, GUI Hong, GAO Xiang, et al//China Medical Equipment,2019,16(6):149-152.
[Abstract] Objective: T o evaluate objectively the established rat pneumonia model caused by intranasal inoculation so as to provide experimental basis for the followed mechanism study of prevention and treatment of pneumonia. Methods: 24 SD male rats were divided into control group (n=12) and experimental group randomly (n=12), and each group was further divided into 4 subgroups as 0, 5, 10 and 15 days post intervention, with 3 rats in each subgroup. The rats in all groups were intervened by intranasal inoculation, and their lung tissue samples and bronchoalveolar lavage fluid (BALF) were collected from every sub-group at 0, 5, 10 and 15 days post intervention. And then, the lung index, the white blood cell count, IL-4, TNF-α, IFN-γ and the amount of pseudomonas aeruginosa (PA) in BALF were detected. And the results of different subgroups of two group were further compared. Results: After intervention, the lung index of the experimental group increased gradually with the time prolonged (from 5d to 15d), which was different to that of control group significantly (t =-2.46, t =-3.26, t =-3.73, P <0.05). The number of white blood cell in BALF of the experimental sub-group were significantly higher than those of control sub-group. And IL-4 and TNF-αin in BALF of experimental group appeared growing trend after molding intervention, and the differences of them between the two groups were significant (t =4.24, t =4.88, P <0.05), while IFN-γ was opposite. The number of PA in BALF of the experimental group appeared increasing trend with time extension after molding intervention. Conclusion: The rat pneumonia model are constructed successfully from PA by intranasal inoculation can be used in the mechanism study of prevention and treatment with traditional Chinese medicine (TCM) for pneumonia.
[Key words] Pseudomonas aeruginosa; Intranasal inoculation; Pneumonia; Bronchoalveolar lavage fluid
[First-author’s address] Beijing Key Lab of Basic Study on Infections Diseases of T raditional Chinese Medicine, Beijing Hospital of T raditional Chinese Medicine, Capital Medical University, Beijing Institute of T raditional Chinese Medicine, Beijing 100010, China.
[摘要] 目的：客观评价已建立的滴鼻途径感染致肺炎大鼠模型，为后续肺炎防治机制研究提供实验依据。

方法：将24只SD 雄性大鼠按随机数表法分为对照组和实验组，每组12只，两组均按干预后0 d、5 d、10 d和15 d分为4个亚组，每组3只。

以滴鼻途径干预，采集干预0 d、5 d、10 d和15 d的各亚组肺泡灌洗液(BALF)及肺组织样本，检测其肺指数、BALF中白细胞数、免疫炎性因子IL-4、TNF-α和IFN-γ的表达及铜绿假单胞菌数量，并分别与对照组的相应亚组比较分析。

结果：实验组大鼠肺指数在造模干预后，随时间延长5 d、10 d和15 d逐渐增大，与对照组相比差异有统计学意义(t =-2.46，t =-3.26，t =-3.73；P ＜0.05)；BALF中白细胞数均明显高于相应对照亚组，BALF中IL-4和TNF-α在造模干预后均呈增长趋势，两组比较差异有统计学意义(t =4.24，t =4.88；P ＜0.05)，IFN-γ则呈下降趋势；BALF中铜绿假单胞菌数在造模干预后，随时间延长呈增多趋势。

结论：成功构建的滴鼻感染耐药铜绿假单胞菌致大鼠肺炎模型，可用于中医药防治肺炎的机制研究。

[关键词] 铜绿假单胞菌；滴鼻；肺炎；肺泡灌洗液DOI: 10.3969/J.ISSN.1672-8270.2019.06.039
丁军颖① 桂 红② 高 翔② 崔煦然① 丁雪霏① 卢幼然① 安世栋① 洪燕英② 刘清泉①*
滴鼻感染铜绿假单胞菌致大鼠肺炎模型的评价
*
*基金项目：北京市自然科学基金(7182071)“基于TLR4-IRAK1-TRAF6探索芪归银对耐药PA所致肺炎微环境的调控机制”；国家自然科学基金(81503399、81373813)“基于HMGB1/RAGE/TLR2/4探索扶正透邪方对肺炎大鼠免疫失衡的逆转机制”“基于β-内酰胺酶和外膜蛋白探讨扶正透邪方对铜绿假单胞菌耐药性的作用机制”；首都医科大学附属北京中医医院院级课题(YJ-201734)“基于MAPK探索芪归银方对耐药菌致肺炎微环境的分子调控机制”
①首都医科大学附属北京中医医院北京市中医研究所中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室 北京 100010②首都医科大学附属北京中医医院检验科 北京 100010*通信作者：Profliu1@
作者简介：丁军颖，女，(1977-)，博士，副教授，研究方向：耐药菌感染及其防治机制研究。

中国医学装备2019年6月第16卷第6期 China Medical Equipment 2019 June V ol.16 No.6
耐药菌所致肺炎的防治是国际医学界面临的难题[1]。

近年来，我国因临床多耐药菌株和泛耐药菌株频现，致使其防治工作面临前所未有的挑战，因此，稳定可靠的耐药菌致肺炎模型是其必备的首要环节[2-3]。

本研究课题组前期已建立不同感染途径的耐药菌致大鼠肺炎模型，在此对优选出的滴鼻途径模型做进一步评价，尤其对肺部疾病特异性标本—肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluid，BALF)进行针对性评价，以期为后续机制研究工作
奠定基础[4]。

1 材料与方法1.1 实验菌种
铜绿假单胞菌耐药株。

编号PA-R003，储备于中医感染性疾病基础研究北京市重点实验室，此菌经由北京中医药大学东直门医院、首都医科大学附属北京朝阳医院和首都医科大学附属北京中医医院3家三甲医院互证鉴定。

开展实验时，以常规方法复苏培养，获取新鲜菌液使用。

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1.2 实验动物及分组
选取24只SD雄性大鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)，6～8周龄，体重(160±10)g；按随机数表法分为对照组和实验组，每组12只；干预当日设为 0 d，干预后第5 d、10 d和15 d分别监测，设为各组的不同时间点为4个亚组，每组3只。

实验过程中如有死亡自动舍弃。

模型干预前适应饲喂3 d，实验过程中分笼饲养，每笼4只。

饲养条件为恒温(20±4)℃，光照及黑暗12 h交替，自由进食并饮水。

1.3 仪器与试剂
全波长K3酶标仪(美国Thermo公司)；干扰素(interferon-γ，IFN-γ)、肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白细胞介素(interleukin-4，IL-4)的ELISA试剂盒均为上海依科赛生物制品有限公司产品。

1.4 干预方法及样本采集1.4.1 造模干预
分别称重两组大鼠，以戊巴比妥钠常规实施麻醉，将大鼠鼻孔处于45°向上倾斜，以0.6 ml浊度值为1的新鲜铜绿假单胞菌菌液，用微量加样器滴入鼻腔，随后改变大鼠体位，使其保持直立体位，大约1 min，以确保菌液进入气道。

对照组则用0.6 ml生理盐水按上述方法滴鼻。

1.4.2 样本采集
(1)BALF：实施造模干预后2 h，将实验组和对照组各自0 d亚组大鼠分别无菌开胸，结扎左主支气管，行右肺的肺泡灌洗。

BALF的制备: 以一次性输液器插入主支气管约3～4 cm，固定，将3 ml生理盐水注入气管内，轻翻肺组织，抽回再灌注，反复抽注5次，最后抽出BALF。

按上述操作，再次以3 ml生理盐水灌洗，收集灌洗液，混匀后计数白细胞；另取1 ml进行常规接种培养；剩余则以400 g，离心10 min，收获上清备检。

此外，分别于造模干预后的第5 d、10 d和15 d，将各组大鼠称重后麻醉，待麻醉稳定后，按前述方法收集BALF并处理备用。

(2)肺组织：分别于造模干预并获取BALF后，将实验组和对照组0 d、5 d、10 d和15 d亚组大鼠的左右叶全肺组织均切下，称重记录。

1.5 指标检测
(1)肺指数：麻醉前称量各大鼠的体质量，肺泡灌洗后再称量切取的总肺组织的质量，其计算为公式1：
肺指数=肺质量/体质量×100% (1)(2)白细胞数：对BALF中的白细胞行“希利格式”计数，4个大方格白细胞总数为N，原始体积肺泡灌洗液中的白细胞数量计算为公式2：
白细胞数(109/L)=(N×10×20÷4)×106 (2)(3)炎性因子浓度水平：严格按照ELISA试剂盒说明书操作，检测BALF中IL-4、TNF-α和IFN-γ的
A 450吸光度值，根据标准品的浓度-吸光度值曲线得出相应浓度。

(4)病原菌数：以1 ml的BALF进行常规接种培养，24 h后计数目的菌落，得出BALF的总病原菌数量。

1.6 统计学方法
采用SPSS 19.0软件进行统计学处理，经正态分
布分析及方差齐性检验，正态分布的数据以(x
-±s )表示，非正态分布数据则以中位数表示。

两组比较采用t 检验，多组比较采用单因素方差分析，以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果
2.1 两组肺指数比较
造模干预后实验组大鼠的肺指数较对照组逐渐增加，两组造模干预后5 d、10 d和15 d肺指数比较差异有统计学意义(t =-2.46，t =-3.26，t =-3.73；P ＜0.05)，见表1。

造模干预后0～10 d，随时间延长实验组肺指数逐渐增大；10 d与15 d大鼠肺指数比较，其差异无统计学意义，见图1。

2.2 BALF 中白细胞计数比较
造模干预后实验组大鼠BALF中白细胞较对照组明显增多；但随时间延长白细胞数量变化不大，5 d、10 d与15 d各亚组间差异无统计学意义，见图2。

表1 两组大鼠肺指数比较(x
-±s
)中国医学装备2019年6月第16卷第6期 滴鼻感染铜绿假单胞菌致大鼠肺炎模型的评价*-丁军颖 等
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图1
造模干预后两组大鼠肺指数
图2
肺泡灌洗液中的白细胞计数
2.3 两组BALF 中免疫炎性因子浓度水平比较
在大鼠肺泡灌洗液中免疫炎性因子I L -4、TNF-α和IFN-γ结果中，造模干预后实验组大鼠BALF中IL-4和TNF-α浓度水平较对照组均明显升高，差异有统计学意义(t =4.24，t =4.88；P ＜0.05)。

其中，IL-4在造模干预后2 h至15 d，即整个监测期内，表达量随时间延长逐渐增加；TNF-α也随时间延长总体呈增加趋势，但15 d较10 d值略降，总体计算结果无统计学差异；IFN-γ则随时间延长总体呈下降趋势，在0～5 d下降明显，5～15 d间则趋于稳定。

5～15 d比较差异无统计学意义，见表2。

表2 两组大鼠肺泡灌洗液中免疫炎性因子浓度水平比较(pg/ml ，x
-±s
)2.4 BALF 细菌计数比较
以常规平板菌落计数法，换算后获得各亚组肺泡灌洗液的菌落数，见表3。

干预当日实验组与对照组有差别，但差异无统计学意义；随时间延长实验组病原菌数增多，两组5 d、10 d和15 d的差异均有统计学意义(t =1.68，t =3.54，t =1.41；P ＜0.05)，见表3。

3 讨论
肺指数是衡量大鼠肺炎发生与否的最直接指标，本研究实验中，肺指数因感染耐药菌而持续增高，这与以往研究相近[5]。

但实验中组内差异较大，这可能与前期采血彻底与否有关；也可能受不同实验人员采集BALF的影响，产生了较大的误差；此外，亚组内动物数较少，且随实验进展有死亡，这些均是造
成组内误差较大的原因。

但实验组肺指数在造模干预后较对照组总体趋势升高，这标志着大鼠肺部炎症的发生。

BALF的白细胞与外周血白细胞协同反映炎症机体的感染免疫应答水平，BALF中白细胞尤其反映呼吸道渗出的炎症状况[6]。

本研究中，自造模干预5 d，BALF白细胞即处于持续增多状态，表明实验组大鼠呼吸道进入相对稳定的感染状态。

正常机体内Th1和Th2细胞处于相对平衡状态，维持着机体正常的细胞及体液免疫[7-8]。

Th1类细胞分泌TNF-α和IFN-γ等，可介导与胞内致病原有关的细胞免疫[9-10]；Th2类细胞则产生IL-4等，与体
表3 两组大鼠BALF 菌数变化结果比较(x
-±s
)中国医学装备2019年6月第16卷第6期 滴鼻感染铜绿假单胞菌致大鼠肺炎模型的评价*-丁军颖 等
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收稿日期：2019-03-05
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Th1/Th2比例失衡及刺激产生的细胞因子均可引起机体异常免疫应答，这是气道炎症调控的关键[11-12]。

铜绿假单胞菌干预时，可影响机体多种炎性因子的表达[13-15]。

本研究以Th1/Th2失衡在气道炎症的异常免疫反应中的关键作用为切入点，以IFN-γ和IL-4这一对拮抗细胞因子作为研究对象，同时关注炎性应答网络核心调控分子TNF-α的表达。

发现PA所致肺炎模型在干预2 h后至15 d，BALF 中IL-4和TNF-α均表达升高，IFN-γ表达降低，这与以往相近研究总体变化趋势一致，提示本实验肺炎造模成功[10,16]。

在本研究实验中采用平板培养菌落计数法，不同大鼠个体间的免疫应答差异、实验进程中的死亡脱组以及不同实验者的操作差异均是造成标准差较大的原因，但实验组目的菌绝对意义的增多能表明其是肺炎发生的主导原因。

本研究实验中铜绿假单胞菌所致肺炎模型的肺指数增加，BALF系列因子表达出现炎性改变，同时存在致病耐药铜绿假单胞菌增加，均提示铜绿假单胞菌致肺炎模型建立成功，为后续研究奠定了基础。

中国医学装备2019年6月第16卷第6期 滴鼻感染铜绿假单胞菌致大鼠肺炎模型的评价*-丁军颖 等。