核酸荧光染色技术应用

正常标本
吸光度正常 Hgb正常
乳糜标本
吸光度偏高 Hgb偏高
▪ WBC异常高值标本(白血病等)
SLS-血红蛋白法在WBC小于20万/uL时不受影响 K-4500,SF-3000,SE-9000,XE, XT可彻底消除此干扰
特殊病例所致MCV假性升高
✓ 高渗状态 ✓ 红细胞凝集 ✓ 小淋巴细胞大量出现 ✓ 样品长时间放置
SE-9000/ RAM-1
XE-2100
SF/R-500
SF-3000
pocH F series
K-4500 KX-21
SE-9000
价 格 万美元
10
XE-2100的位置
独立的IMI检测通道
IMI通道检测原理
试剂反应前的细胞形态
细胞膜脂质较少
幼稚细胞
细胞膜脂质较多
正常细胞
IMI通道检测原理
高渗状态对MCV的影响
高血糖（>600mg/dl）、高血脂、高血钠、高尿素氮，如 高钠性脱水、严重尿毒症、糖尿病、静脉输注葡萄糖、 标本采集错误。
血中
稀释液中
葡萄糖
水分子
高糖对MCV的影响
16
15.5
14
12
10
8
7
6
4
2
2
0
0
5.9
56
84
1高值
小淋巴细胞大量出现
血常规检查中的误差分析及核酸荧光染色技术的应用希森美康公司马文新血常规实验中误差来源不同生理状态不同生理状态仪器运行状态仪器运行状态配套试剂配套试剂样品处理样品处理特殊病例特殊病例特殊病例所致白细胞测定误差白细胞假性升高白细胞假性升高凝血及血细胞凝集凝血及血细胞凝集冷凝蛋白沉淀冷凝蛋白沉淀红细胞溶血不良红细胞溶血不良存在有核红细胞存在有核红细胞大血小板大血小板疟原虫疟原虫白细胞假性降低白细胞假性降低白细胞凝集白细胞凝集特殊病例所致红细胞测定误差红细胞假性升高红细胞假性升高样品未充分混匀样品未充分混匀处于脱水状态处于脱水状态大量白细胞干扰大量白细胞干扰大血小板大血小板红细胞假性降低红细胞假性降低红细胞凝集红细胞凝集样品未充分混匀样品未充分混匀特殊病例所致血红蛋白质假性升高wbc异常高值标本白血病等离心后血浆部分用稀释液置换后测定sls血红蛋白法在wbc小于20万ul时不受影响k4500sf3000se9000xext可彻底消除此干扰正常标本乳糜标本吸光度正常hgb正常吸光度偏高hgb偏高特殊病例所致mcv假性升高红细胞凝集红细胞凝集小淋巴细胞大量出现小淋巴细胞大量出现样品长时间放置样品长时间放置高渗状态高渗状态特殊病例所致血小板测定误差血小板假性升高血小板假性升高红细胞碎片红细胞碎片白细胞碎片白细胞碎片冷蛋白沉淀冷蛋白沉淀血小板卫星现象血小板卫星现象血小板假性降低血小板假性降低血小板凝集血小板凝集edtaedta所致假性血小板所致假性血小板减少减少大血小板大血小板功能进展的两大趋势完善对成熟细胞的检测性能完善对成熟细胞的检测性能白细胞
成花环 ▪ 肿瘤产生的粘多糖
白细胞的凝集
<WBC直方图>
白细胞的凝集-寒冷型和非寒冷型
寒冷型:加热到37OC后再测定 非寒冷型:离心后用生理盐水置换血浆
红细胞凝集
冷凝集素（Cold agglutinin) ✓ IgM型自身抗体。 ✓ 红细胞冷凝集素滴度较低。 ✓ 多克隆：支原体肺炎、传单。 ✓ 单克隆：淋巴增殖性疾病（如淋巴瘤），慢
血常规检查中的误差分析
及核酸荧光染色技术的应用
希森美康公司 马文新
血常规实验中误差来源
▪ 不同生理状态 ▪ 仪器运行状态 ▪ 配套试剂 ▪ 样品处理 ▪ 特殊病例
特殊病例所致白细胞测定误差
▪ 白细胞假性升高
✓ 凝血及血细胞凝集 ✓ 冷凝蛋白沉淀 ✓ 红细胞溶血不良 ✓ 存在有核红细胞 ✓ 大血小板 ✓ 疟原虫
RBC 3.74x1012/l HGB 11.8g/dl HCT 38.5% MCV 102.9fl MCHC 30.6g/dl WBC 800x109/l
破碎红细胞的出现
▪ 盔形红细胞综合症-血流障碍
– 小血管障碍性溶血性贫血 – 大血管障碍性溶血性贫血
▪ 烧伤引起的溶血性贫血
细胞骨格
▪ 行军性血红蛋白尿症-行军、马拉松、空手道等
特殊病例所致血小板测定误差
▪ 血小板假性升高
✓ 红细胞碎片 ✓ 白细胞碎片 ✓ 冷蛋白沉淀
▪ 血小板假性降低
✓ 血小板凝集 ✓ EDTA所致假性血小板
减少 ✓ 血小板卫星现象 ✓ 大血小板
功能进展的两大趋势
▪ 完善对成熟细胞的检测性能
✓ 白细胞：五分类/ EO/ BA ✓ 血小板：PLT方法学
▪ 发展不成熟细胞的检测功能
破碎白细胞的出现
AML、淋巴瘤、严重感染、化疗等
用目视法测定 用XE、XT 、 R系列仪器测定
血小板凝集
冷凝集素所造成的血小板凝集 加温到37OC后再测定 重新采血
血小板卫星现象(Platelet Satellism)
起因于EDTA盐，特别易 附着于中性粒细胞的周围
巨大血小板
电阻法 3.2x104/uL
PLT-O 65 [10^9/L]
有核红细胞分析
▪ NRBC单独检测计数, 提升仪器的检测能力
▪ 自动从白细胞中扣除 NRBC，得到更准确 的白细胞计数和分类 结果
不断创新的产品！
XE-2100
XT-2000i/1800i
Sysmex血液分析产品概况
二、三分类
功 能 、 档 次
小型五分类
大型五分类
▪ 模块式自动化-5分类+推/ 染片机+读片机
✓ XE-alpha
五分类血液分析仪检测技术
▪ 方法学进展
✓ 物理法
激光、射频、电阻
✓ 细胞化学
染色
✓ 物理 + 细胞化学
Sysmex专利技术： 核酸荧光染色+半导体流式细胞分析
白细胞五项分类技术进展
▪ 第三代物理光源 半导体激光。 大幅度提升实用性能
✓ 寿命长：7 - 10年 ✓ 体积小 ✓ 启动快 ✓ 电耗小 ✓ 对稳压要求低 ✓ 更为经济
白细胞五项分类技术进展
▪ 细胞化学技术：核酸荧光染色
✓ 区别于酸碱染色、酶染色、糖原染色 ✓ 不同细胞亚群、不同成熟阶段，表现不同的
着色性
核酸的含量 核酸的结构 DNA/RNA的比例
✓ 核酸荧光荧光物质: Auramine-O ✓ 核酸荧光染色物质: Polymethine
巨大血小板
核酸荧光染色法
5.6x104/uL
用目视法测定 用XE、XT 、 R-3500等测定
RBC 4.35 × 1012/L HGB 145 g/L HCT 0.435 MCV 100.0 fL MCH 33.3 pg MCHC 333 g/L RDW 0.147
红细胞凝集的解离
✓ 冷凝集素所造成的红细胞凝集 加温到37OC后在测定
✓ 自我免疫所造成的红细胞凝集 离心后血浆部分用生理盐水置换
肝硬化病人的红细胞溶血不良
正常人RBC
肝硬化病人RBC
溶血剂滴下后
肝硬化病人的红细胞溶血不良 测定成功例
<WBC直方图>
<测量值>
WBC
6.9×109/L
LYM% F1* 0.343 MXD% F2* 0.194 NEUT% 0.463
肝硬化病人的红细胞溶血不良
测定失败例
<WBC直方图>
<测定值>
✓ 形态分辨能力进一步提高 ✓ 提高线性 ✓ 实用性能增强
血小板计数双方法
阻抗法
低可信度？
光学法
巨大血小板的检测
PLT-I 32 [10^9/L]
<PLT Flag> PLT clumps? PLT Abn distribution? Thrombocytopenia?
巨大血小板的检测
巨大血小板的检测
✓ 白细胞类：IG/ HPC ✓ 红细胞类： NRBC / RET/ RET分类
产品进展
▪ 白细胞二分类仪器：F800/F820 ▪ 白细胞三分类仪器：KX21, K4500, pocH ▪ 白细胞五分类仪器
✓ 多通道阻抗法：SE9000 ✓ 激光染色法：SF3000 ✓ 核酸荧光染色法：XE2100, XT1800i/XT2000i
NEUT% WL* 0.651
PLT
288 × 109/L
PLT AG 271 × 109/L
PDW 11.2 fL
PDW
12.0 fL
MPV
9.4 fL
MPV
9.6 fL
P-LCR 0.213
P-LCR
0.232
冷凝蛋白沉淀
(Cryo-Protein、Cryo-Globulin、Cryo-Fibrinogen)
性冷凝集素病，良性单克隆丙球血症。 ✓ 血清学：冷凝集素阳性。
红细胞凝集
RBC RU* 2.23 ×1012/L
HGB
144 g/L
HCT RU* 0.249
MCV RU* 111.7 fL
MCH RU* 64.6 pg
MCHC RU* 578 g/L
RDW * 0.254
加温30分钟后红细胞凝集解离
Promyelocyte Myelocyte Metamyelocyte Band
异淋
Atypical Lymph
血小板计数技术进展
▪ 电阻法
✓ 检测数目多，重复性好；稳定；经济 ✓ 不能形态分辨，混淆小红细胞、细胞碎片和大血小板
▪ 激光法
✓ 能一定程度上分辨形态 ✓ 提高线性
▪ 核酸荧光染色染色+激光法
通过目视法确认,从白细胞中减去NRBC XE-2100可彻底消除此干扰
大血小板的出现
MDS、脾亢
通过目视法确认
可在XE、XT 、 R系列上正确测定WBC
疟原虫
通过目视法确认 XE, XT可彻底消除此干扰
白细胞的凝集
▪ 单核细胞增多症、感染性疾病、自身免疫 性疾病
▪ 高滴度冷凝素 ▪ EDTA抗凝：中性粒细胞围绕未成熟细胞形
核左移 EO
侧向散射 (内部结构)
电阻抗检测原理与三分类
核酸荧光染色与半导体激光流式细胞技术
半导体激光器 (=633nm)
双色分光镜
光电倍增管 （荧光信号）
光电倍增管 （侧向散射光信号）
流动室
光电二极管 （前向散射光信号）
激光流式细胞检测原理与五分类
双角度散射光
DIFF通道细胞形态变化
Baso通道细胞形态变化
RF
DC
XT-2000i/1800i的位置
将用血量降至最低的XE
多种进样模式
自动进样器/ 人工密闭试管
150
人工模式
85
末梢血模式
XE/XT检测功能比较
XT-1800i
RBC/PLT-I
Yes
WBC WBC DIFF
Yes
DIFF WBC/BASO Yes
IMI
No
HGB
Yes
RET RET
No
荧光信号分析的特异性
侧向荧光： DNA/RNA信息
侧向散射光： 细胞内结构信息
前向散射光： 细胞体积信息
激光束 (=633nm)
正常细胞信息的二维定位
核 酸 染 色 量
Baso
Population
内部结构
LMNE Population
异常细胞在散点图中的位置
Atypical Lymph
Blast
▪ 白细胞假性降低
✓ 白细胞凝集
特殊病例所致红细胞测定误差
▪ 红细胞假性升高
✓ 样品未充分混匀 ✓ 处于脱水状态 ✓ 大量白细胞干扰 ✓ 大血小板
▪ 红细胞假性降低
✓ 红细胞凝集 ✓ 样品未充分混匀
特殊病例所致血红蛋白质假性升高
▪ 乳糜标本(高脂血症) ▪ 高胆红素血症
离心后血浆部分用 稀释液置换后测定
PLT-O
No
NRBC
No
XT-2000i Yes Yes Yes No Yes Yes Yes No
XE-2100 Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes Yes
重视特殊病例所致测定误差
▪ 重视人工镜检 ▪ 注意样品前处理 ▪ 加强与临床的交流 ▪ 熟悉仪器报警信息
的含义
凝血及血小板凝集
▪ 冷球蛋白：如多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症、 淋巴增殖性疾病、转移性肿瘤、自身免疫性疾病、 感染性疾病。 ▪ 冷纤维蛋白原：如多发性骨髓瘤、癌、白血病、 妊娠、口服抗凝剂、肺栓塞、糖尿病。
37OC加温测定
离心后用生理盐水置换血浆后再行测定
红细胞溶血不良
✓肝功能低下(肝硬化、肝癌晚期、胆道堵塞) ✓异常血红蛋白症(Hgb-S症、Hgb-C症) ✓高脂血症 ✓高胆固醇制剂输液治疗过程中
与半导体激光有很好的适配性，633nm激发荧光
核酸荧光染色对白细胞检测的意义
▪ 更准确的WBC分类结果，排除干扰因素 ▪ IG：准确检测未成熟粒细胞 ▪ OTHER：提供异常淋巴、原粒细胞信息
核酸染色下的异常细胞信息
原始/ 异淋细胞
荧
IG 光
(RNA ,DNA)
MO LY
NE-BA
Ghost，PLT凝块
✓血栓前状态 ✓取血不顺利 ✓采血后混匀不好 ✓抗凝剂量少
采血时组织液的混入
<WBC直方图>
<PLT直方图>
WBC
<测量值>
5.4 × 109/L
WBC WL* 6.3 × 109/L
LYM% 0.190
LYM% WL* 0.231
MXD% 0.115
MXD% WL* 0.118
NEUT% 0.695
WBC WL* LYM% WL MXD% WL NEUT%WL
90.9×109/L -.---.---.---
离心后血浆部分用生理盐水置换后再行测定 K-4500,SF-3000,SE-9000,XE, XT可彻底消除此干扰
幼红细胞的出现
脐带血、新生儿、溶血性贫血
<WBC直方图>
WBC 56.1X109/L
试剂反应：硫化氨基酸的附着
细形胞成膜保脂护质层较少
幼稚细胞
细 未胞 形膜成脂保质护较层多
正常细胞
IMI通道检测原理
试剂反应：表面活性剂—溶解正常细胞
保持原来状态 形成保护层
幼稚细胞
细胞被溶解 未形成保护层
正常细胞
HPC检测
测量体积
测量内部结构
造血干细胞与HPC参数
造血干细胞与HPC参数
HPC检测