一种从发酵液中提取己二酸的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201710622975.1
(22)申请日 2017.07.27
(71)申请人 江南大学
地址 214122 江苏省无锡市蠡湖大道1800
号
(72)发明人 邓禹　赵梅　毛银　赵运英　
卢伟强　陆春波　
(74)专利代理机构 哈尔滨市阳光惠远知识产权
代理有限公司 23211
代理人 张勇
(51)Int.Cl.
C07C 51/42(2006.01)
C07C 51/43(2006.01)
C07C 51/47(2006.01)
C07C 51/48(2006.01)
C07C 55/14(2006.01)C12P 7/44(2006.01)
(54)发明名称
一种从发酵液中提取己二酸的方法
(57)摘要
本发明公开了一种从发酵液中提取己二酸
的方法，属于生物工程领域。

本发明的方法是将
发酵液经过固液分离、超滤、浓缩、离子交换、溶
液萃取、蒸发和结晶等步骤处理后，获得成品己
二酸产品。

采用本发明的提取方法提取得到的己
二酸收率和纯度都达到较高的水平，最终收率高
达71.7％，纯度可达95.
86％。

权利要求书1页 说明书5页CN 107382706 A 2017.11.24
C N 107382706
A
1.一种从发酵液中提取己二酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)固液分离：发酵液去除菌体和杂质后，收集发酵液清液；
(2)超滤：利用超滤膜系统，将发酵液清液中的大分子蛋白及高分子杂质去除，收集超滤透过液；
(3)浓缩：浓缩超滤透过液；
(4)离子交换：将浓缩后的发酵液加入到经碱洗、去离子水洗、酸洗、去离子水洗至中性的阳离子交换树脂中，搅拌均匀，使树脂充分吸附后，过滤收集滤液；
(5)溶剂萃取：将收集到的滤液使用酸调节pH至酸性，然后使用有机溶剂萃取，收集萃取液；
(6)蒸发：蒸发萃取液中的有机溶剂；
(7)结晶：将旋转蒸发剩余的液体于4-8℃低温结晶，结晶后，于20-40℃进行完全结晶，得到己二酸成品。

2.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵液中己二酸含量为10-30g/L。

3.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(1)中的发酵液是以重组大肠杆菌Mad2ΔatoB发酵得到；所述重组大肠杆菌Mad2ΔatoB是以敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自褐色喜热裂孢菌的异源基因β-酮硫解酶基因，3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因，3-羟基己二酰脱氢酶基因，5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因，己二酰辅酶A合成酶基因片段Tfu_2576、Tfu_2577；其中，β-酮硫解酶基因、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因以pRSFDuet-1为表达载体；3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因以pTrc99a为表达载体；己二酰辅酶A合成酶基因片段Tfu_2576、Tfu_2577以pCDFDuet-1为表达载体。

4.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(2)中超滤膜系统采用的超滤膜元件为卷式膜，超滤膜的截留分子量为500-3000。

5.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(3)中浓缩是将超滤透过液浓缩至超滤液的60-90％。

6.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中的阳离子交换树脂为732阳离子交换树脂；阳离子交换树脂的预处理方式为：首先用去离子水将阳离子交换树脂清洗3次，后用NaOH调节pH至10，搅动半小时后，用去离子水冲洗直至pH中性后加H 2SO 4调节pH至1，然后再用去离子水冲洗至中性。

7.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(4)中所述阳离子交换树脂的活性基团为H +。

8.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(5)中的有机溶剂为乙醇、甲醇或乙酸乙酯。

9.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(5)中的有机溶剂的体积为滤液的2-4倍，萃取次数为3次。

10.根据权利要求1所述方法，其特征在于，所述步骤(6)中的蒸发是将有机溶剂蒸发至萃取液的10-20％。

权　利　要　求　书1/1页CN 107382706 A
一种从发酵液中提取己二酸的方法
技术领域
[0001]本发明涉及一种从发酵液中提取己二酸的方法，属于生物工程领域。

背景技术
[0002]己二酸(Adipic acid，adipate)又称肥酸，是一种重要的有机二元酸，广泛应用于化工生产、有机合成工业、医药、润滑剂制造等方面。

[0003]目前己二酸的生产方式主要采用空气氧化法或硝酸氧化法，但是此种方法的产品收率低于60％，废水量排放量较大，原料和中间产物毒性很强，而且过程中产生大量的N2O 等温室气体，环境污染严重且不可持续。

因此，人们将目光聚焦到生物合成己二酸的道路上，且做了大量的基础工作。

以葡萄糖为底物全生物合成己二酸具有工艺流程简单、总投入成本低、可循环利用等突出优点，因此备受研究人员青睐。

但是这些方法均未涉及到发酵液中己二酸的提取，在发酵液中提取己二酸主要存在的问题是发酵液中杂酸多，难以分离一种有机酸，纯度无法保证。

而且菌生长状况等因素，也会导致发酵液中的有机酸提取比较困难。

[0004]本发明从葡萄糖为底物全生物合成己二酸的发酵液中提取己二酸，回收率达60％以上，纯度达90％以上。

方法简单绿色，提取出来的己二酸纯度高，无需二次处理，可直接使用。

发明内容
[0005]本发明的目的在于提供一种从发酵液中提取己二酸的方法，所述方法包括如下步骤：
[0006](1)固液分离：发酵液去除菌体和杂质后，收集发酵液清液；
[0007](2)超滤：利用超滤膜系统，将发酵液清液中的大分子蛋白及高分子杂质去除，收集超滤透过液；
[0008](3)浓缩：浓缩超滤透过液；
[0009](4)离子交换：将浓缩后的发酵液加入到经碱洗、去离子水洗、酸洗、去离子水洗至中性的阳离子交换树脂中，搅拌均匀，使树脂充分吸附后，过滤收集滤液；
[0010](5)溶剂萃取：将收集到的滤液使用酸调节pH至酸性，然后使用有机溶剂萃取，收集萃取液；
[0011](6)蒸发：蒸发萃取液中的有机溶剂；
[0012](7)结晶：将旋转蒸发剩余的液体于4-8℃低温结晶，结晶后，于20-40℃进行完全结晶，得到己二酸成品。

[0013]在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的发酵液中己二酸含量为10-30g/L。

[0014]在本发明的一种实施方式中，所述步骤(1)中的发酵液是以重组大肠杆菌Mad2△atoB发酵得到；所述重组大肠杆菌Mad2△atoB是以敲除了atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)为宿主，分模块过量表达来自褐色喜热裂孢菌的异源基因β-酮硫解酶基因，3-羟酰基-辅酶
A脱氢酶基因，3-羟基己二酰脱氢酶基因，5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因，己二酰辅酶A 合成酶基因片段Tfu_2576、Tfu_2577；其中，β-酮硫解酶基因、3-羟酰基-辅酶A脱氢酶基因以pRSFDuet-1为表达载体；3-羟基己二酰脱氢酶基因、5-羧基-2-戊烯酰辅酶A还原酶基因以pTrc99a为表达载体；己二酰辅酶A合成酶基因片段Tfu_2576、Tfu_2577以pCDFDuet-1为表达载体。

[0015]在本发明的一种实施方式中，所述发酵液的制备是：重组大肠杆菌Mad2△atoB种子液以2％的接种量接种至装有3L SOB培养基的5L发酵罐中，搅拌转速400rpm，通气量1vvm，2M NaOH维持pH为6.8～7.2，发酵温度37℃，培养至OD600为0.6-0.8时加1mM IPTG，降温至30℃诱导；待发酵培养基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/L的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/L。

[0016]在本发明的一种实施方式中，所述SOB培养基的成分为2g/100ml胰蛋白胨、0.5g/ 100ml酵母粉、0.05g/100ml NaCl、2.5mM KCl、10mM MgCl2、0.8g/100ml葡萄糖、50μg/ml硫酸卡那霉素、50μg/ml氨苄青霉素、50μg/ml链霉素。

[0017]在本发明的一种实施方式中，所述步骤(2)中超滤膜系统采用的超滤膜元件为卷式膜，超滤膜的截留分子量为500-3000。

[0018]在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)中的浓缩是将超滤透过液浓缩至超滤液的60-90％。

[0019]在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中的阳离子交换树脂为732阳离子交换树脂；阳离子交换树脂的预处理方式为：首先用去离子水将阳离子交换树脂清洗3次，后用NaOH调节pH至10，搅动半小时后，用去离子水冲洗直至pH中性后加H2SO4调节pH至1，然后再用去离子水冲洗至中性。

[0020]在本发明的一种实施方式中，所述步骤(4)中的阳离子交换树脂的活性基团为H+。

[0021]在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的有机溶剂为乙醇、甲醇或乙酸乙酯。

[0022]在本发明的一种实施方式中，所述步骤(5)中的有机溶剂的体积为滤液的2-4倍，萃取次数为3次。

[0023]在本发明的一种实施方式中，所述步骤(6)中的蒸发是将有机溶剂蒸发至萃取液的10-20％。

[0024]本发明的优点在于：使用此方法提取发酵液中的己二酸纯度高，产率高，节约时间及原料，降低生产成本。

采用本发明的方法，己二酸最终收率高达71.7％，纯度可达95.86％。

[0025]本发明将膜分离技术应用到己二酸提取中，有效去除发酵液中的大分子蛋白及糖类物质，有利用乙酸乙酯的萃取，有效避免了加入乙酸乙酯后形成乳浊液，无法分层，使得提取产物不纯的问题。

具有自动化程度高、能耗低、污染小等优势。

[0026]本发明采用阳离子树脂进行离子交换，可最大程度去除在发酵液中引入的盐分，有效避免了在提取过程中反复调节pH。

[0027]本发明在离子交换前采用膜过滤及浓缩，减轻了树脂的污染，并延长树脂使用寿命；另一方面也有效提升了树脂的吸附量和处理效率。

具体实施方式
[0028]实施例1：重组大肠杆菌Mad2△atoB的获得
[0029]Tfu_0875、Tfu_2399、Tfu_0068、Tfu_1648、Tfu_2576、Tfu_2577的序列已于申请日前在NCBI中公布。

[0030]EcoR I和HindIII双酶切质粒pRSFDuet-1，切胶回收目的基因片段(3798bp)，用同样的酶酶切质粒pUC57-Tfu_0875，切胶回收得到目的基因片段Tfu_0875，然后将两个目的片段用T4DNA连接酶连接，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pRSF-Tfu_0875。

Bgl II和Kpn I酶切质粒pRSF-Tfu_0875，切胶回收4936bp的目的基因片段，用同样的酶酶切质粒pUC57-Tfu_2399，切胶回收目的基因片段，然后将两个目的片段用T4DNA连接酶连接，化转JM109，菌落PCR挑取阳性转化子，并提取质粒酶切验证，验证正确后的质粒命名为pAD-1。

[0031]其他质粒使用同样的方法进行构建，最终片段Tfu_0068、Tfu_1648通过NcoⅠ、Hind Ⅲ连接到质粒pTrc99a上形成pAD-4质粒；Tfu_2576、Tfu_2577通过NcoⅠ、HindⅢ连接到质粒pCDFDuet-1上形成pAD-6质粒。

[0032]将pAD-1、pAD-4、pAD-6转入已敲除atoB基因的大肠杆菌BL21(DE3)中，制备得到重组大肠杆菌Mad2△atoB。

参见专利CN106834200A。

[0033]实施例2：上罐发酵及结果分析
[0034]3L培养基：SOB培养基，成分为2％胰蛋白胨+0.5％酵母粉+0.05％NaCl+2.5mM KCl +10mM MgCl2+8g/L葡萄糖+50μg/ml硫酸卡那霉素+50μg/ml氨苄青霉素+50μg/ml链霉素，补料加100g/L甘油。

[0035]种子液制备：甘油保藏的菌种于平板上划线，挑取单菌落接种于盛有50ml的LB液体培养基的250ml锥形瓶中，37℃、250rpm/min摇瓶过夜。

次日取500μl菌液转接于60ml LB 液体培养基中，37℃、250rpm培养至OD600达到0.6-0.8时，接种于5L发酵罐中。

[0036]发酵条件：2％接种量，37℃培养至OD600为0.6-0.8左右时加1mM IPTG 30℃诱导，搅拌转速400rpm，通气量1vvm，2M NaOH维持pH为6.8～7.2。

待发酵培养基里面的葡萄糖消耗剩2g/L左右时补加甘油，以维持甘油浓度在4g/L的速度进行补料，直至甘油补加总量达到100g/L。

[0037]结果分析：发酵过程中每4h取一次样，10000r/min离心2min将发酵液与菌体分离，0.22μm滤膜处理发酵液，用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐Aminex HPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm。

上罐发酵己二酸产量为25.57g/L。

[0038]实施例3：发酵液中有机溶剂提取己二酸
[0039]按照以下方法提取实施例2的发酵液中的己二酸：
[0040](1)上罐发酵液首先通过离心机离心去除菌体及杂质，收集发酵液清液；[0041](2)将发酵液清液通过截留分子量为2500的卷式膜过滤以除去大的蛋白及高分子杂质，收集超滤透过液；
[0042](3)将超滤透过液80℃下旋蒸浓缩，将超滤透过液浓缩至超滤液的80％，收集浓缩液；
[0043](4)将浓缩液使用732阳离子交换树脂进行吸附，将发酵液中的Na+进行吸附，置换成H+，首先用去离子水将732阳离子交换树脂清洗3次，后用NaOH调节pH至10，搅动半小时后，交去离子水冲洗直至pH中性后加H2SO4调节pH至1后用去离子水冲洗至中性。

然后将浓缩液加入到阳离子树脂中，搅拌均匀，使树脂充分吸附后，通过漏斗过滤收集滤液；[0044](5)收集完的滤液使用H2SO4调节pH至3左右，后用滤液3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液；
[0045](6)然后60℃旋蒸萃取液，旋蒸至萃取液的10％；
[0046](7)将旋蒸后的液体放于4℃冰箱进行低温结晶，结晶后，放于30℃烘箱中进行完全结晶，结晶后使用液相进行提取率的计算。

[0047]结果分析：每步提纯的液体用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐Aminex HPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm，检测每步损失。

最终收率高达71.7％，纯度可达95.86％。

[0048]实施例4：发酵液中有机溶剂提取己二酸
[0049]按照以下方法提取实施例2的发酵液中的己二酸：
[0050](1)上罐发酵液首先通过离心机离心去除菌体及杂质，收集发酵液清液；[0051](2)将发酵液清液通过截留分子量为500的卷式膜过滤以除去大的蛋白及高分子杂质，收集超滤透过液；
[0052](3)将超滤透过液80℃下旋蒸浓缩，将超滤透过液浓缩至超滤液的90％，收集浓缩液；
[0053](4)将浓缩液使用732阳离子交换树脂进行吸附，将发酵液中的Na+进行吸附，置换成H+，首先用去离子水将732阳离子交换树脂清洗3次，后用NaOH调节pH至10，搅动半小时后，交去离子水冲洗直至pH中性后加H2SO4调节pH至1后用去离子水冲洗至中性。

然后将浓缩液加入到阳离子树脂中，搅拌均匀，使树脂充分吸附后，通过漏斗过滤收集滤液；[0054](5)收集完的滤液使用H2SO4调节pH至3左右，后用滤液3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液；
[0055](6)然后60℃旋蒸萃取液，旋蒸至萃取液的20％；
[0056](7)将旋蒸后的液体放于8℃冰箱进行低温结晶，结晶后，放于40℃烘箱中进行完全结晶，结晶后使用液相进行提取率的计算。

[0057]结果分析：每步提纯的液体用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐Aminex HPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm，检测每步损失。

最终收率达62.2％，纯度可达96.1％。

[0058]实施例5：发酵液中有机溶剂提取己二酸
[0059]按照以下方法提取实施例2的发酵液中的己二酸：
[0060](1)上罐发酵液首先通过离心机离心去除菌体及杂质，收集发酵液清液；[0061](2)将发酵液清液通过截留分子量为3000的卷式膜过滤以除去大的蛋白及高分子杂质，收集超滤透过液；
[0062](3)将超滤透过液80℃下旋蒸浓缩，将超滤透过液浓缩至超滤液的85％，收集浓缩液；
[0063](4)将浓缩液使用732阳离子交换树脂进行吸附，将发酵液中的Na+进行吸附，置换
成H+，首先用去离子水将732阳离子交换树脂清洗3次，后用NaOH调节pH至10，搅动半小时后，交去离子水冲洗直至pH中性后加H2SO4调节pH至1后用去离子水冲洗至中性。

然后将浓缩液加入到阳离子树脂中，搅拌均匀，使树脂充分吸附后，通过漏斗过滤收集滤液；[0064](5)收集完的滤液使用H2SO4调节pH至3左右，后用滤液3倍体积的乙酸乙酯萃取3次，收集萃取液；
[0065](6)然后60℃旋蒸萃取液，旋蒸至萃取液的15％；
[0066](7)将旋蒸后的液体放于4℃冰箱进行低温结晶，结晶后，放于20℃烘箱中进行完全结晶，结晶后使用液相进行提取率的计算。

[0067]结果分析：每步提纯的液体用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐Aminex HPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm，检测每步损失。

最终收率高达72.5％，纯度可达91.3％。

[0068]实施例6：发酵液中有机溶剂提取己二酸
[0069]省略步骤(2)的超滤步骤，其他步骤与实施例3一致，结果发现加入乙酸乙酯萃取时形成乳浊液，无法分层或者分层不明显，需要离心进一步分离，若离心还不行，则下步将无法进行，提取不能完成。

这步省略不仅加倍了工作量，耗时，浪费乙酸乙酯。

[0070]实施例7：发酵液中有机溶剂提取己二酸
[0071]省略步骤(3)的浓缩步骤，其他步骤与实施例3一致，结果发现所有试剂的用量增加，工作处理量增加，由于每步处理量多，因此损失也会增加。

[0072]结果分析：每步提纯的液体用于进行HPLC(高效液相色谱法，美国伯Bio-Rad伯乐Aminex HPX-87H有机酸柱)检测，HPLC检测中流动相为5mM H2SO4，柱温为30℃，紫外检测器210nm，检测每步损失。

最终收率高达45.3％，纯度可达87.6％。

[0073]实施例8：发酵液中半制备液相提取己二酸
[0074](1)上罐发酵液首先通过离心机离心去除菌体及杂质，仅留下发酵液。

[0075](2)卷式膜过滤以除去大的蛋白及高分子杂质。

[0076](3)将过滤后的发酵液通过waters1525半制备液相进行收集。

[0077]结果分析：发酵液进行HPLC(高效液相色谱法，Waters Xbrige C18)检测，HPLC检测中流动相为A:MeOH(80％)、B:H2O(20％)，梯度洗脱运行时间为25min，柱温为40℃，紫外检测器210nm，检测每步损失。

最终收率高达83％，纯度可达100％。

但是此方法耗时，需要使用较多的甲醇，成本较高。

而且半制备液相需要人为操作，一般手动，耗费人力。

[0078]虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。