第9章动物基因工程
动物基因工程
动物基因工程
动物基因工程是农业和食品生产中利用生物技术来修改和优化
动物基因组以实现预期目标的一种技术。
它涉及研究和开发改良动物性状，提高动物产量，增强动物健康，改善食品品质和动物营养，以及建立更安全，更有效和更合理的动物繁殖和饲养方法等。
动物基因工程可以把有用的基因组合插入动物体内，以获得更好的性状和能力，从而提高生产效率。
它的应用可以从肉类，乳制品，蛋类，水果和蔬菜等多个方面来看，改善产品的质量和性能，增加其生产量和可持续性。
实施动物基因工程的主要技术有转基因技术和编辑技术。
转基因技术通过将有用的基因插入动物体内来修改它们的性状，通常是将来自其他生物体中的基因插入动物体内。
编辑技术则是在动物体内编辑现有基因，而不是添加新基因，以获得预期的性状。
动物基因工程也是值得讨论的话题，它有助于提高食品安全，增强抗性，延长保质期，改善质量，提高产量，简化品种，等等。
这些改变的从繁殖和遗传学角度都是永久的，即使留下的影响是未知的也可以预见。
当然，它也可能带来一些负面影响，例如引发环境污染或威胁多样性。
因此，必须在研究和使用动物基因工程技术时，严格遵守环境和健康安全法规，并进行足够的监管。
总之，动物基因工程在提高动物的性能和效率方面提供了一种新的途径，但实施此项技术要非常小心，以确保安全和优势的持续使用。
- 1 -。
《动物基因工程》课件
动物基因工程面临的挑战
技术难度
动物基因工程涉及到复杂 的生物学和遗传学知识， 技术难度较大。
伦理和法律问题
动物基因工程涉及到伦理 和法律问题，需要制定相 应的法规和伦理规范。
社会接受度
动物基因工程需要得到社 会的广泛接受和支持，需 要加强宣传和教育。
增强农业生产力
动物基因工程可以提 高农业生产效率，保 障粮食安全。
THANKS
感谢观看
生态平衡维护
基因工程动物释放到环境中可能对生态平衡产生影响，引发伦理考 量。
基因歧视
基因工程动物可能引发对某些人群的基因歧视，需要关注平等和公正 的伦理原则。
国际动物基因工程法规
《关于转基因生物安全性的准则》
联合国粮食及农业组织与世界卫生组织共同制定的国际法规，旨在确保转基因生物的安全使用 和释放。
常见的基因修饰动物包括基因敲入动物、基因 敲除与敲入相结合的动物、条件性基因敲除动 物等。
基因修饰动物制备过程中需要关注基因修饰位 点的选择、修饰效率、表型变化等多个因素， 以确保基因修饰动物的制备成功和实验效果。
04
动物基因工程伦理与法规
动物基因工程伦理问题
动物权益保护
基因工程对动物福利的影响，如疼痛、疾病和死亡在实验过程中所 涉及的伦理问题。
福利。
动物基因表达调控
1 2
基因表达调控机制
包括转录水平调控、转录后水平调控和翻译水平 调控等。
调控方式
包括DNA甲基化、组蛋白修饰、miRNA调节等 。
3
调控的意义
通过调控基因表达，可以影响动物的生长发育、 生理功能和行为表现等。
09转基因动物与生物反应器-HXY78页PPT
转基因动物技术路线
外源目的基因的制备 外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
选择获得携有目的基因的细胞 选择合适的体外培养系统和宿主动物
转基因细胞胚胎发育及鉴定 筛选所得的转基因动物品系
哺乳动物生殖生理
哺乳动物受精和妊娠，整乳动物的制备方法
显微注射法 逆转录病毒载体感染 胚胎干细胞介导法 精子载体介导法 YAC介导的基因转移
1 显微注射法
雄性原核
显
受精卵
微
注
射
显微注射
法
操
作
胚胎移植
流
程
后定检测
显微注射法的优点
a、转移率较高、整合效率达30%； b、外源基因长度可达50Kb； c、方法简单，导入过程直观；
缺点
a、设备昂贵、操作复杂； b、随机整合、首尾相连的多拷贝； c、常造成插入位点附近宿主DNA大片
段缺失、重组等突变，出现动物严重 生理缺陷； d、外源基因能否稳定整合要到子一代 中筛选得到。
1987年美国科学家戈登（Gordon）等 人首次在小鼠的奶中生产出一种医用蛋 白──tPA（组织型纤溶酶原激活物）， 展示了用动物乳腺生产高附加值产品的 可能性。利用动物乳腺生产高价值产品 的方式称为乳腺生物反应器。
微生物反应器 植物反应器 动物反应器
(一) 优点 1可以利用发酵工程 技术大规模生产。 2 胞外活性物质制备 容易。 （二）不足 1哺乳动物或人类的 基因往往不能表达。 有些表达了，却没有 活性，需要进一步修 饰。 2真核生物蛋白质翻 译后加工的精确性有 限。 3需要大型发酵设备 和车间。 4细菌发酵常形成不 溶聚合物，使下游加 工成本增加。
疾病模型
基因转移方法
转导的基因
基因工程知识点
基因工程各章知识点第一章绪论1．基因工程的首例操作实验三大理论基础：DNA是遗传物质、DNA的双螺旋结构和半保留复制、遗传密码的破译和遗传物质传递方式的确定三大技术基础：限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割、DNA连接酶的发现与DNA片段的连接、基因工程载体的研究与应用基因工程的诞生：72年，P.Berg首次实现体外DNA重组：体外用EcoRI分别切割SV40和λDNA,并用T4 DNA连接酶连接成为重组的杂种DNA分子73年，S.Cohen 体外重组DNA并转化：具Kanr的E.Coli质粒R6－5和具Tetr的E.Coli质粒pSC101切割并连接转化的大肠杆菌具有双重抗性S.Cohen 和H.Boyer首次实现真核基因在原核中表达：将非洲爪蟾的DNA与E.Coli质粒（pSC101）体外切割并连接，转化大肠杆菌2．基因工程的基本概念基因工程是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种新物体（受体）内，使之稳定遗传并表达出新产物或具有新性状的DNA体外操作技术，也称为分子克隆或重组DNA 技术。
供体、载体、受体是基因工程的三大基本元件。
3．基因工程的基本操作过程a分离目的DNA片段：酶切、PCR扩增、化学合成等。
b重组：体外连接的DNA和载体DNA，形成重组DNA分子。
c转化：将重组DNA分子导入受体细胞并与之一起增殖。
d筛选：鉴定出获得了重组DNA分子的受体细胞。
e对获得外源基因的细胞或生物体通过培养，获得所需的遗传性状或表达出所需要的产物。
第二章载体1．理解用PBR322和PUC18作载体的克隆外源基因的原理。
答案不确定PBR322作载体的克隆外源基因的原理:PBR322质粒具有12 种限制性内切酶的单一识别位点：Tet r 基因内有7个酶切位点：Bam HⅠ，SalⅠ：Amp r基因内有3 个酶切位点：PstⅠ。
Eco RⅠ和HindⅢ不在抗生素基因内，不导致插入失活。
第一章 基因工程概述
或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基
本元件。
基因工程的基本概念
B 基因工程的基本定义
基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，
包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的
是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技
术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模
酶工程
基因工程的基本概念
D 基因工程的基本形式
第一代基因工程 蛋白多肽基因的高效表达 经典基因工程 第二代基因工程 蛋白编码基因的定向诱变 蛋白质工程
第三代基因工程 代谢信息途径的修饰重构 途径工程
第四代基因工程 基因组或染色体的转移
基因组工程
第二节 基因工程的诞生和发展
一、基因
泛基因阶段
孟德尔遗传因子阶段
（如胰岛素）、干扰素、乙肝疫苗等 研制新型疫苗（HIV、霍乱、单纯疱疹病毒等）
生产具有药用价值的生物制剂，如水蛭素等
3. 基因诊断
– 遗传性疾病的分子诊断
– 癌症的分子诊断 – DNA指纹
4. 基因治疗
是指将外源正常基因导入靶细胞，以纠正或补偿因基因缺陷和异 常引起的疾病，以达到治疗目的。
3．断裂基因
1个基因被间隔区分成不连续的若干区段，这种编码序列不连续的间断基因被称为 断裂基因。
4．假基因
不能合成出功能蛋白质的失活基因 。
5．重叠基因
不同基因的核苷酸序列有时是可以共用的 即重叠的。
现代对基因的定义是DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列， 是遗传物质的最小功能单位。
二、 基因工程的诞生
顺反子阶段
1957 年，本泽尔（Seymour Benzer）以T4噬菌 体为材料，在DNA分子水平上研究基因内部的精细结 构，提出了顺反子（cistron）概念。 顺反子是1个遗传功能单位，1个顺反子决定 1条多肽链。
动物病毒学课件第9章 单链DNA病毒
➢WUH-1株全长4.8kb
➢进化分析证实属于博卡病毒
NP1 NS1
VP1/2
PBoV-4F
犊牛的腹泻，给养牛业造成了巨大损失
猪博卡样病毒是不是博卡病毒？
由于以前的研究只是通过部分基因片段和进化系 统树分析推测并命名为猪博卡样病毒，没有从全 基因组水平上证实，因此猪博卡样病毒是否属于 博卡病毒还需要进一步验证。
猪博卡样病毒WH-1株的全基因组序列分析
➢根据报道的1.8kb 的序列从临 床上检测到阳性样品，采用简 并引物方法获得了WH-1株的 全基因组序列
✓75℃以上加热处理后，病毒的血凝效价几乎完全 消失，弱酸性到中性的介质适于血凝特性的保持。
3.培养
➢细胞：
✓猪源cell：原代猪肾、猪睾丸细胞 传代细胞系PK-15、IBRS-2
✓人的某些传代cell系：Hela、Hep-2
➢接种方式： ✓同步接种 ✓细胞长成单层前接种
➢病毒的增殖需要正处于有丝分裂期的细胞的某些机 能的辅助。
第九章 单链DNA(ssDNA)病毒
➢9.1 细小病毒科（Parvoviridae) ➢9.2 圆环病毒科（Circoviridae)
9.1 细小病毒科（Parvoviridae)
DNA replication ξ=10-10-10-9 RNA transcription ξ=10-5-10-4 ssDNA 细小病毒 ξ=8×10-4
犬细小病毒
肠炎、心肌炎、白细胞减少
水貂肠炎病毒 白细胞减少、肠炎
水貂阿留申病毒 慢性免疫复合物疾病、脑炎
鹅细小病毒
肝炎、肠炎、心肌炎
猫泛白细胞减少 大脑发育全、白细胞减少、肠炎
症病毒
牛细小病毒
犊牛腹泻
动物基因工程ppt课件
（2）腺相关病毒（adeno-associated virus,AAV）
腺相关病毒是一种天然复制缺陷型非致病性 单链DNA病毒，其复制需要有辅助病毒的共转 染。无共转染时，野生型AAV优先（70%） 整合在人染色体的19q13.3位点处，潜伏存在 直至被辅助病毒拯救出来。其整合需要基因组 两端的ITR，以及非结构基因编码的蛋白 Rep78 和Rep68的存在。
34
原病毒DNA 转染进包装 细胞中，包 装原病毒产 生将病毒 RNA包装成 感染性病毒 粒子的所有 蛋白质，但 却不能包装 自身的RNA
图 4逆转录病毒载体稳定、长期表达外源基因
35
第三节 转基因动物制备
转基因动物的制备程序 转基因鉴定 表达水平的检测 转基因动物传代与检测
36
一 转基因动物的制备程序
13
以山羊乳腺特性表达载体pBC1为例
14
2. 病毒载体
作为基因转移的病毒载体须具备以下 基本条件： 携带外源基因并能够包装成病毒颗粒 介导外源基因的转移与表达
对机体不致病
15
（1）腺病毒（adenovirus）
腺病毒作为转染载体有许多特点： • 基因组的重排率低 • 外源基因与病毒DNA重组后能遗传几个 周期 • 安全性好，不会整合到人的染色体上， 不导致肿瘤的发生 • 宿主范围广，对受体细胞是否处于分裂 期要求不高 • 外源基因在载体上容易高效表达
11
动物基因工程载体
质粒型表达载体 病毒载体 定向打靶载体
12
1 .质粒型表达载体
表达载体的共同特点是都带有原核复制 区和选择性标记基因，保证重组DNA分子能 够在大肠杆菌中扩增，同时也必须包括能在 真核细胞表达的相关组件。一般包括转录外 源DNA序列的启动元件、转录产物有效地加 上poly（A）尾巴所必需的信号序列、真核 细胞中的选择性标记，另外还增加了一些附 加元件，如增强子、内含子、剪接供体与受 点，以保证外源基因的高效表达。
《基因工程》课程教学大纲
《基因工程》课程教学大纲课程名称：基因工程课程类别：专业主干课适用专业：生物技术考核方式：考试总学时、学分：32 学时 2 学分其中实验学时：0 学时一、课程教学目的通过对本门课程的学习，使学生掌握基因工程技术的基本原理、常用技术和工作思路，了解基因工程技术的应用及发展趋势，为进一步学习有关专业课及参加相关领域的生产和科研工作奠定基础。
二、课程教学要求本门课是以遗传学、生物化学、微生物学、细胞生物学、分子生物学等学科为基础的学科，要求学生有扎实的上述课程基础。
本课程的主要内容包括: 基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定、大肠杆菌基因工程、酵母菌基因工程、高等动物基因工程、高等植物基因工程等。
要求学生掌握基因工程的基本原理和常用方法与技术，了解该领域的研究动态与发展方向。
课程的基本内容随着本学科的发展而调整并限定其广度和深度，在保证达到一定培养规格的前提下，考虑学生的接受能力和学习负担，同时注意本课程和其它相关课程的相互联系与衔接，防止疏漏和不必要的重复。
三、先修课程生物化学、微生物学、遗传学、细胞生物学、分子生物学。
四、课程教学重、难点教学重点：基因工程载体、基因工程的酶学基础、目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
教学难点：目的基因的克隆、ＤＮＡ连接和转化、转化子的筛选与重组子的鉴定。
五、课程教学方法与教学手段以教师讲授为主，要求教师认真备课，熟悉本课程的基本内容以及该学科的最新发展趋势，以合适的形式进行教学，提倡采用多媒体作为辅助教学手段；学生可以通过阅读相关的英文资料了解本学科的研究状况与发展方向，也可以阅读一些感兴趣的参考资料，训练其针对所感兴趣的问题进行深入探讨的能力。
六、课程教学内容第一章概述（1学时）1．教学内容（1）基因工程的概念；（2）基因工程的发展和历史；（3）基因工程的研究意义。
2．重、难点提示（1）重点：基因工程的概念；（2）难点：基因工程的基因原理及在生物工程中的地位。
《动物基因工程》课件
转基因动物制备
经过基因转移技术处理后 ，将胚胎移植到代孕母体 中，最终获得转基因动物 。
动物基因编辑技术
CRISPR-Cas9系统
01
CRISPR-Cas9系统是一种高效的基因编辑工具，可用于在动物
基因组中引入特定突变或敲除特定基因。
基因敲除
02
通过基因编辑技术敲除动物某个基因，以研究该基因的功能或
基因工程起源于20世纪70年代， 当时科学家发现了DNA双螺旋结
构，为基因操作奠定了基础。
关键发展阶段
在随后的几十年中，基因工程经历 了多个关键发展阶段，包括重组 DNA技术、基因转移技术、基因 编辑技术的发展和应用。
当前应用
目前，基因工程已经在医学、农业 、工业和基础研究中得到广泛应用 ，为人类带来了巨大的利益。
造出具有新性状的生物。
02
基因工程原理
基因工程基于分子生物学的基本原理，包括DNA双螺旋结构、基因表
达和基因重组等。通过操作DNA，可以改变生物体的遗传信息，从而
改变其性状。
03
基因工程操作步骤
基因工程包括基因克隆、载体构建、转化、筛选和表达等步骤，这些步
骤是实现基因操作的关键。
基因工程发展历程
基因工程的起源
基因工程应用领域
医学领域
基因工程在医学领域的应用包括治疗遗传性疾病、癌症和 其他疾病。例如，基因治疗和免疫治疗等技术已经应用于 临床实践。
工业领域
基因工程在工业领域的应用包括生物制药、生物燃料和生 物降解塑料等。这些技术的应用为工业生产提供了更加环 保和高效的解决方案。
农业领域
基因工程在农业领域的应用包括改良作物品质、提高抗逆 性和抗虫性等。转基因作物已经成为现代农业的重要组成 部分。
基因工程知识点全
第一章基因工程概述1。
什么是基因工程，基因工程的基本流程？基因工程(Genetic engineering）原称遗传工程.从狭义上讲,基因工程是指将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组,然后转入另一种生物体(受体）内，使之按照人们的意愿遗传并表达出新的性状。
因此，供体、受体和载体称为基因工程的三大要素.1。
分离目的基因2。
限制酶切目的基因与载体3.目的基因和载体DNA在体外连接4.将重组DNA分子转入合适的宿主细胞，进行扩增培养5。
选择、筛选含目的基因的克隆6。
培养、观察目的基因的表达第二章基因工程的载体和工具酶1. 基因工程载体必须满足哪些基本条件？➢具有对受体细胞的可转移性或亲和性。
➢具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点。
➢具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点。
➢具有合适的筛选标记.➢分子量小，拷贝数多.➢具有安全性。
2。
质粒载体有什么特征，有哪些主要类型？1、自主复制性2、可扩增性3、可转移性4、不相容性主要类型有1。
克隆质粒2.测序质粒3.整合质粒4。
穿梭质粒5.探针质粒6。
表达质粒3。
质粒的构建(1）删除不必要的 DNA 区域，尽量缩小质粒的分子量,以提高外源 DNA 片段的装载量.一般来说，大于20Kb 的质粒很难导入受体细胞,而且极不稳定.(2)灭活某些质粒的编码基因，如促进质粒在细菌种间转移的 mob 基因，杜绝重组质粒扩散污染环境,保证 DNA 重组实验的安全，同时灭活那些对质粒复制产生负调控效应的基因，提高质粒的拷贝数（3）加入易于识别的选择标记基因，最好是双重或多重标记，便于检测含有重组质粒的受体细胞。
（4）在选择性标记基因内引入具有多种限制性内切酶识别及切割位点的 DNA序列，即多克隆接头（Polylinker)，便于多种外源基因的重组，同时删除重复的酶切位点,使其单一化，以便环状质粒分子经酶处理后，只在一处断裂，保证外源基因的准确插入。
（5)根据外源基因克隆的不同要求，分别加装特殊的基因表达调控元件。
动物基因工程及应用PPT课件
动物基因工程的应用需要符合相关政策要求。例如，在医学研究中，需要遵循伦 理审查和实验动物管理规定等。
未来发展前景与展望
发展前景
随着技术的不断进步和伦理观念的转变，动物基因工程的应用前景广阔。例如，基因改造动物可用于药物研发、 疾病模型建立等领域。
展望
未来，动物基因工程将更加注重技术突破和伦理问题的解决，以实现更加安全、有效和可持续的应用。同时，国 际合作和政策制定也将在推动动物基因工程的发展中发挥越来越重要的作用。
发展阶段。
2000年代至今
随着CRISPR-Cas9等基因编 辑技术的出现，动物基因工程
取得了突破性进展。
动物基因工程的应用领域
生物医药
利用动物基因工程生产 用于药物研发、疾病治 疗和预防的蛋白质和抗
体。
农业
生物反应器
培育抗病、抗虫、高产、 优质的新品种动物，提 高畜牧业生产效率和经
济效益。
利用转基因动物作为生 物反应器，生产具有重 要价值的蛋白质和药物。
的基因导入到动物基因组中。
打靶后动物的筛选与鉴定
03
通过分子生物学技术，对打靶后动物进行筛选和鉴定，确保获
得所需打靶动物。
03
CHAPTER
动物基因程的应用实例
转基因动物的生产与应用
转基因动物
通过基因工程技术将外源基因 导入动物细胞，使动物获得新
的性状或功能。
应用领域
生物制药、疾病模型、生物反 应器等。
对人类和动物的潜在影响
食品安全与健康
基因工程动物可能携带新 的基因，对人类健康存在 潜在风险，需要加强食品 安全监管。
伦理与道德问题
基因工程动物的出现引发 了关于动物权益、人道对 待和伦理准则的讨论。
基因工程原理练习题及其答案
基因工程复习题题型：名词解释（10个）30分；填空（每空1分） 20分；选择题（每题1分）10分；简答题（4个）20分；论述题（2个）20分。
第一章绪论1.名词解释：基因工程：按照预先设计好的蓝图，利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
遗传工程广义：指以改变生物有机体性状为目标，采用类似工程技术手段而进行的对遗传物质的操作，以改良品质或创造新品种。
包括细胞工程、染色体工程、细胞器工程和基因工程等不同的技术层次。
狭义：基因工程。
克隆：无性(繁殖)系或纯系。
指由同个祖先经过无性繁殖方式得到的一群由遗传上同一的DNA分子、细胞或个体组成的特殊生命群体。
2．什么是基因克隆及基本要点?3.举例说明基因工程发展过程中的三个重大事件。
A) 限制性内切酶和DNA连接酶的发现（标志着DNA重组时代的开始）；B) 载体的使用；C) 1970年，逆转录酶及抗性标记的发现。
4.基因工程研究的主要内容是什么？基础研究：基因工程克隆载体的研究基因工程受体系统的研究目的基因的研究基因工程工具酶的研究基因工程新技术的研究应用研究：基因工程药物研究转基因动植物的研究在食品、化学、能源和环境保护等方面的应用研究第二章基因克隆的工具酶1.名词解释：限制性核酸内切酶：一类能识别双链DNA中特殊核苷酸序列，并使每条链的一个磷酸二酯键断开的内脱氧核糖核酸酶。
回文结构：双链DNA中的一段倒置重复序列，当该序列的双链被打开后，可形成发夹结构。
同尾酶：来源不同、识别序列不同，但产生相同粘性末端的酶。
同裂酶：不同来源的限制酶可切割同一靶序列和具有相同的识别序列黏性末端：DNA末端一条链突出的几个核苷酸能与另一个具有突出单链的DNA末端通过互补配对粘合，这样的DNA末端，称为粘性末端。
平末端：DNA片段的末端是平齐的。
第9章 基因功能与基因组学 习题
第9章基因工程与基因组学习题一、名词解释1.标记基因：指与目标性状紧密连锁、同该性状共同分离且易于识别的可遗传的等位基因变异。
2.cDNA库：是以mRNA为模板，经反转录酶合成互补DNA构建的基因库。
3.克隆（无性繁殖系）选择学说：一个无性繁殖系是指从一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代，是具有相同遗传性状的群体。
经过选择培养，可以获得无性系变异体，但其遗传性状不一定有差异，在适当的培养条件下可产生逆转。
4.基因组：一个物种的单倍体细胞中所含有的遗传物质的总和称为该物种的基因组。
5.遗传多态现象：同一群体中存在着两种以上变异的现象。
通常不同变异型间易于区别，不存在中间类型，而且遗传方式清楚。
例如人的ABO血型就是遗传多态，这个血型系统由同一基因座上的3个等位基因决定，各型间区分明确，在同一地区有一定的频率分布。
6.基因芯片：所谓基因芯片，是指利用大规模集成电路的手段，控制固相合成成千上万个寡核苷酸探针，并把它们有规律地排列在指甲大小的硅片上，然后将要研究的材料，如DNA或cDNA用荧光标记后在芯片上与探针杂交，再通过激光共聚焦显微镜对芯片进行扫描，并配合计算机系统对每一个探针上的荧光信号作出比较和检测，从而迅速得出所需的信息。
7.BAC文库（bacterial artificial chromosome，细菌人工染色体文库）：BAC是人工染色体的一种，是以细菌F因子（细菌的性质粒）为基础组建的细菌克隆体系。
8.Ti质粒：在根瘤土壤杆菌细胞中存在的一种染色体外自主复制的环形双链DNA分子，称为Ti质粒，它控制根瘤的形成，Ti是英文tumor-inducing（肿瘤的诱发）的略语。
可作为基因工程的载体。
9.穿梭载体（shuttle vector）：指既能在真核细胞中繁殖，又能在原核细胞中繁殖的载体。
它既含有原核细胞的复制原点，又含有真核生物的复制原点，而且又具备可利用的酶切位点和合适的筛选指标。
二、是非题1.限制性内切酶EcoRI对一定核甘酸顺序的切割位点是G↓AATTC CTTAA↑G。
基因工程-第9章-外源基因的表达
故又称为TATA盒或—10区。启动子来源不同，
Pribnow盒的碱基顺序稍有变化。
-35区，位于转录起始位点上游35bp处， 故称-35区，一般由10个碱基组成。一般认为， -35区是RNA聚合酶σ亚基的识别与结合位点。 当σ亚基附着在-35区后，便带动RNA聚合酶 的核心酶(core enzyme，无σ亚基的RNA聚合 酶)沿DNA链向转录起始方向滑动至Pribnow盒， 并与之接触，而一旦它们相互结合之后，σ亚
转录终止子，目的是为了稳定载体系统。因
为上游强的tac启动子控制的转录必须由强终
止子抑制，才不至于干扰与载体本身稳定性 有关的基因 表达。
2.分泌型克隆表达载体pIN Ⅲ系统
这个载体系统是以pBR322为基础构建的。
它带有大肠杆菌中最强的启动子之一，即
Ipp(脂蛋白基因)启动子。ห้องสมุดไป่ตู้启动子的下游装
1. 启动子 启动子是DNA链上一段能与RNA聚合酶
结合并能起始mRNA合成的序列，它是基因表 达不可缺少的重要调控序列。没有启动子， 基因就不能转录。
原核生物启动子是由两段彼此分开且又 高度保守的核苷酸序列组成，对mRNA的合成 极为重要。
Pribnow盒，位于转录起始位点上游5～
10bp，一般由6～8个碱基组成，富含A和T，
点，即有一段富含A/T的区域和一段富含G／
C的区域，G／C富含区域又具有回文对称结 构，这段终止子转录后形成的RNA具有茎环
结构，并且具有与A/T富含区对应的一串U。
4．衰减子
衰减子(attenuator)是指在某些前导序列中 带有控制蛋白质合成速率的调节区。在原核 生物中，一条mRNA分子常常编码数种不同的 多肽链。这种多顺反子mRNA的头一条多肽链 合成的起始点，同RNA分子的5’-P末端间的距 离可达数百个核苷酸。这段位于编码区之前 的 不 转 译 的 mRNA 区 段 ， 叫 做 前 导 序 列 (1eader)。此外，在mRNA的3'-OH末端，以及 在多顺反子mRNA中含有的长达数百个碱基的 顺反子间序列(intercistranic-sequence)，即间隔 序列 (spacer)，也发现有不转译的序列。
第9章 动物基因工程
4 增加目的基因拷贝数 单拷贝或低拷贝目的基因，无论表达载体调控元件如何 优化、整合的染色体位点多么合适，其外源基因表达量 都是有限的。因此，通过增加目的基因拷贝数来获得高 表达重组药物的工程细胞株是基因工程药物研究中不可 或缺的一步。目的基因的扩增常采用目的基因和选择标 记基因共扩增的方法，
三、动物细胞转化方法与筛选 1 基因的导入方法
二、动物细胞表达载体的构建 目的基因在哺乳动物细胞中的表达受整合目的基因的染
色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、 翻译和翻译后加工修饰效率的影响。构建一个高效表达的 哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位 点的优化，转录翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增 加等方面综合考虑。下面分别从转录水平和翻译水平的调 控元件、整合位点的优化以及增加目的基因拷贝数等方面 对此作一介绍。
磷酸骨架相互作用形成的复合物被细胞内吞。 （7）脂质体法
脂质体（liposome encapsulation）是由天然脂类和 类固醇组成的微球，
脂质体转染法可能的机理是阳离子脂质体与带负电的 基因依靠静电作用形成脂质体基因复合物，该复合物因阳 离子脂质体的过剩正电荷而带正电，借助静电作用吸附于 带负电的细胞表面，再通过与细胞膜融合或细胞内吞作用 而进入细胞内，脂质体基因复合物在细胞质中可能进一步 传递到细胞核内释放基因，并在细胞内获得表达。
[课件]动物基因工程及应用PPT
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• 转基因技术在基因研究中的应用，大致有三种情况： a. 同源重组灭活细胞内源基因 转基因进入动物细胞内后，通常会发生随机整合， 这不能灭活内源同源基因。但当转基因与细胞内基因 组中某区域具有高度同源性时，转基因便能准确地与 基因组中的同源重组。但在高等哺乳类动物体内则十 分罕见，其同源重组频率只及随机整合的千分之一。 然而，如果在转基因结构中，携带一个灵敏的标记基 因，便能有效地区分同源重组与随机整合，筛选出所 期望的细胞株，并将之输回雌性动物的胚胎中。在其 子代体内观察转基因的表型。 b. 反义RNA或反义DNA抑制内源基因表达 这种战略是通过抑制mRNA转录而关闭内源基因，
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第一节 动物基因工程的基本概念
• 一、转基因与转基因生物 转基因生物（Genetical modified Orgamism，GMO； Transgenic Organism，TO）：含有转基因并为其遗传 修饰了的动植物发育为个体。 转基因通常是指在基因操作过程中整合到动植物 受体细胞基因组中的外源基因。从八十年代初以来， 动物的转基因技术已得到了长足的进展，转基因鼠、 绵羊。猪、兔、牛、鸡等都已相继获得成功，人类的 转基因技术目前局限在体细胞的基因治疗方面，具有 遗传特征修饰的转基因人研究仍受到伦理学和法学的 束缚，末能跨出第一步，但这并不意味着在技术上有 不可逾越的障碍。
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• 2.腺病毒（Adenovirus） 线状双链DNA，36kb,包装上限37.8kb, 修饰后上限4kb。 3.牛痘病毒 185kb，操作困难, 先以重组病毒感染细胞，使其大量 表达T7 RNA聚合酶，然后再将含有外源基因和T7启 动子的细菌重组质粒以脂质体的方式导入细胞。经过 一段时间预培养，外源基因即在T7 RNA聚合酶作用下 转录并翻译出异源蛋白。 4.逆转录病毒 整合型单链RNA病毒，装配大小8kb。感染后，由逆 转录酶作用下，形成双链DNA，插入寄主基因组复制， 转录成mRNA，装配分泌到胞外，不造成宿主细胞死 亡。
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•3. 整合位点的优化 •目的基因在细胞染色体上整合位点区域的状态对于目的 基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中 的稳定性起着决定性的作用。只有那些整合位点处于染 色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的 基因。因此，保证将表达载体整合在 细胞染色体上转录 活跃位点的克隆被挑选出来，是提高细胞表达水平必需 的一步，主要通过以下几种策略实现。
第9章动物基因工程
2020/11/27
第9章动物基因工程
•第一节 动物细胞基因工程
• 采用哺乳动物细胞的蛋白表达具有以下主要优点： •①哺乳动物细胞能识别和除去外源基因的内含子，剪接 加工成成熟的mRNA； •②哺乳动物细胞表达的蛋白质与天然蛋白的结构、糖基 化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，加工 后的蛋白质免疫原性好，约为酵母型的16~20倍； •③哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定 性和可重复性； •④经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基 中，提纯工艺简单，成本低。
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•（6）Vero细胞 • 该细胞是从正常的成年非洲绿猴肾分离获得的， 一株具有贴壁依赖性的成纤维细胞。可持续地进行细 胞培养，并可支持多种病毒的增殖并制成疫苗 。 •（7）鼠骨髓瘤细胞 • 骨髓瘤细胞是“专业”的分泌细胞，在培养上清中 可产生高达100mg/L的免疫球蛋白（Ig），而且容易转 染，容易生长，可在无血清培养基中高密度的悬浮培 养；能对蛋白质进行糖基化修饰；高效表达Ig基因的 调控成分明确，有利于表达载体的增强子和启动子的 合理设计。
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• 2 宿主细胞 • 虽然至今批准的由动物细胞表达的产品，其宿主细胞 几乎都是CHO细胞。但是在实践中，人们发现它也存在着 一些不足， • 因此，近来一些具有良好特征的细胞系都已被作为宿 主细胞试用于真核细胞的表达系统中。 •（1）BHK-21细胞 • 该细胞最早从地鼠幼鼠的肾脏分离，现在广泛应用的 是采用单细胞分离技术经13次克隆的细胞。原始的细胞 株是成纤维样细胞，并且具有贴壁依赖性，但经无数次 传代后细胞可悬浮生长。
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•二、动物细胞表达载体的构建 • 目的基因在哺乳动物细胞中的表达受整合目的基因的染 色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、 翻译和翻译后加工修饰效率的影响。构建一个高效表达的 哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位 点的优化，转录翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增 加等方面综合考虑。下面分别从转录水平和翻译水平的调 控元件、整合位点的优化以及增加目的基因拷贝数等方面 对此作一介绍。
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•（2）CHO-K1细胞 • 该细胞是CHO细胞的一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr— ）的营养缺陷突变株，它可以在氨甲蝶呤(MTX）压力下 使外源基因的基因拷贝数扩增，使外源蛋白质得到较高水 平表达。 •（3）C127细胞 • 该细胞来自RIII 小鼠乳腺肿瘤细胞，适用于带有牛 乳头瘤病毒（BPV）载体的转染。当用BPV-1病毒载体 转染后，细胞的生长形态可发生显著变化，因此转染 成功的细胞可通过特有的转化形态加以识别。
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•一、动物细胞表达体系 • 动物细胞表达系统主要由宿主细胞和表达载体两部 分组成。 •1 表达载体 • 目前常用的表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒 载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞 膜的相互作用使外源基因进入宿主细胞内。常用的病毒载 体有 ： •（1）逆转录病毒（Retrovirus）载体 •（2）腺病毒（Adenovirus，AV）载体 •（3）腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）载 体 •（4）质粒载体
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•（4）MDCK细胞 • 该细胞是从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得 ，是具有贴壁依赖性的上皮样细胞，已成功地在微载体 上增殖。该细胞能支持多种病毒的增殖，已被用来生产 兽用疫苗。 •（5）Namalwa细胞 • 该细胞是一株人的类淋巴母细胞,来自名为 “Namalwa”的Burkitt淋巴瘤患者，含有部分疱疹病毒 基因，但不产生疱疹病毒。该细胞已被批准用于大规 模生产α干扰素，可以用无血清培养基在悬浮状态下 高密度培养，可有效地表达外源基因。
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•（8）COS细胞 • 该细胞是利用复制起点缺失的SV40转染非洲 绿猴肾细胞CV-1而获得，具有COS-1、-3、和-7三 个细胞系。由于COS细胞来源广，易培养，易转染； 能组成性表达SV40大T抗原，能使大多数哺乳动物 细胞携带有复制子的质粒以附加体形式高拷贝扩增； 大量扩增的质粒及其高表达的mRNA和蛋白质，容 易回收和分析，因此被广泛地用于瞬时表达系统。
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•1. 转录水平 • 在目的基因拷贝数一定，整合位点固定的情况下 ，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个 高效表达载体的构建来说显得尤为重要。启动子及其 相应增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对 转录水平的高低及mRNA的稳定性有很大影响，其中强 启动子、强增强子是提高转合结构域特 异识别并结合目标基因的特异调控序列，通过转录激 活结构域调节或将转录作用因子募集至启动子从而启 始基因的转录和表达。因此，提高宿主细胞转录因子 的表达水平也能增强目的基因的表达。
第9章动物基因工程
• 2. 翻译水平 • 除了转录水平的调控外， 翻译水平的调控和翻译产 物的加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要 的影响。Ploy（A）的存在不但能影响mRNA稳定性， 而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高mRNA 翻译水平；内部核糖体进入位点（IRES）能使同一 mRNA中除第1个基因之外的其他基因也得到有效表达 ；翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏 好的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大 幅度提高翻译效率。