第9章动物基因工程
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第9章动物基因工程
•1. 转录水平 • 在目的基因拷贝数一定，整合位点固定的情况下 ，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个 高效表达载体的构建来说显得尤为重要。启动子及其 相应增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对 转录水平的高低及mRNA的稳定性有很大影响，其中强 启动子、强增强子是提高转录水平的关键因素。 • 在转录过程中，转录因子通过DNA 结合结构域特 异识别并结合目标基因的特异调控序列，通过转录激 活结构域调节或将转录作用因子募集至启动子从而启 始基因的转录和表达。因此，提高宿主细胞转录因子 的表达水平也能增强目的基因的表达。
第9章动物基因工程
•（4）MDCK细胞 • 该细胞是从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得 ，是具有贴壁依赖性的上皮样细胞，已成功地在微载体 上增殖。该细胞能支持多种病毒的增殖，已被用来生产 兽用疫苗。 •（5）Namalwa细胞 • 该细胞是一株人的类淋巴母细胞,来自名为 “Namalwa”的Burkitt淋巴瘤患者，含有部分疱疹病毒 基因，但不产生疱疹病毒。该细胞已被批准用于大规 模生产α干扰素，可以用无血清培养基在悬浮状态下 高密度培养，可有效地表达外源基因。
第9章动物基因工程
•3. 整合位点的优化 •目的基因在细胞染色体上整合位点区域的状态对于目的 基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中 的稳定性起着决定性的作用。只有那些整合位点处于染 色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的 基因。因此，保证将表达载体整合在 细胞染色体上转录 活跃位点的克隆被挑选出来，是提高细胞表达水平必需 的一步，主要通过以下几种策略实现。
第9章动物基因工程
2wk.baidu.com20/11/27
第9章动物基因工程
•第一节 动物细胞基因工程
• 采用哺乳动物细胞的蛋白表达具有以下主要优点： •①哺乳动物细胞能识别和除去外源基因的内含子，剪接 加工成成熟的mRNA； •②哺乳动物细胞表达的蛋白质与天然蛋白的结构、糖基 化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，加工 后的蛋白质免疫原性好，约为酵母型的16~20倍； •③哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定 性和可重复性； •④经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基 中，提纯工艺简单，成本低。
第9章动物基因工程
•一、动物细胞表达体系 • 动物细胞表达系统主要由宿主细胞和表达载体两部 分组成。 •1 表达载体 • 目前常用的表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒 载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞 膜的相互作用使外源基因进入宿主细胞内。常用的病毒载 体有 ： •（1）逆转录病毒（Retrovirus）载体 •（2）腺病毒（Adenovirus，AV）载体 •（3）腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）载 体 •（4）质粒载体
第9章动物基因工程
•（6）Vero细胞 • 该细胞是从正常的成年非洲绿猴肾分离获得的， 一株具有贴壁依赖性的成纤维细胞。可持续地进行细 胞培养，并可支持多种病毒的增殖并制成疫苗 。 •（7）鼠骨髓瘤细胞 • 骨髓瘤细胞是“专业”的分泌细胞，在培养上清中 可产生高达100mg/L的免疫球蛋白（Ig），而且容易转 染，容易生长，可在无血清培养基中高密度的悬浮培 养；能对蛋白质进行糖基化修饰；高效表达Ig基因的 调控成分明确，有利于表达载体的增强子和启动子的 合理设计。
第9章动物基因工程
•二、动物细胞表达载体的构建 • 目的基因在哺乳动物细胞中的表达受整合目的基因的染 色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、 翻译和翻译后加工修饰效率的影响。构建一个高效表达的 哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位 点的优化，转录翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增 加等方面综合考虑。下面分别从转录水平和翻译水平的调 控元件、整合位点的优化以及增加目的基因拷贝数等方面 对此作一介绍。
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•（8）COS细胞 • 该细胞是利用复制起点缺失的SV40转染非洲 绿猴肾细胞CV-1而获得，具有COS-1、-3、和-7三 个细胞系。由于COS细胞来源广，易培养，易转染； 能组成性表达SV40大T抗原，能使大多数哺乳动物 细胞携带有复制子的质粒以附加体形式高拷贝扩增； 大量扩增的质粒及其高表达的mRNA和蛋白质，容 易回收和分析，因此被广泛地用于瞬时表达系统。
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• 2 宿主细胞 • 虽然至今批准的由动物细胞表达的产品，其宿主细胞 几乎都是CHO细胞。但是在实践中，人们发现它也存在着 一些不足， • 因此，近来一些具有良好特征的细胞系都已被作为宿 主细胞试用于真核细胞的表达系统中。 •（1）BHK-21细胞 • 该细胞最早从地鼠幼鼠的肾脏分离，现在广泛应用的 是采用单细胞分离技术经13次克隆的细胞。原始的细胞 株是成纤维样细胞，并且具有贴壁依赖性，但经无数次 传代后细胞可悬浮生长。
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• 2. 翻译水平 • 除了转录水平的调控外， 翻译水平的调控和翻译产 物的加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要 的影响。Ploy（A）的存在不但能影响mRNA稳定性， 而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高mRNA 翻译水平；内部核糖体进入位点（IRES）能使同一 mRNA中除第1个基因之外的其他基因也得到有效表达 ；翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏 好的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大 幅度提高翻译效率。
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•（2）CHO-K1细胞 • 该细胞是CHO细胞的一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr— ）的营养缺陷突变株，它可以在氨甲蝶呤(MTX）压力下 使外源基因的基因拷贝数扩增，使外源蛋白质得到较高水 平表达。 •（3）C127细胞 • 该细胞来自RIII 小鼠乳腺肿瘤细胞，适用于带有牛 乳头瘤病毒（BPV）载体的转染。当用BPV-1病毒载体 转染后，细胞的生长形态可发生显著变化，因此转染 成功的细胞可通过特有的转化形态加以识别。
•1. 转录水平 • 在目的基因拷贝数一定，整合位点固定的情况下 ，转录作为基因表达的第一步，提高转录效率对一个 高效表达载体的构建来说显得尤为重要。启动子及其 相应增强子、转录终止信号及多聚腺苷酸加尾信号对 转录水平的高低及mRNA的稳定性有很大影响，其中强 启动子、强增强子是提高转录水平的关键因素。 • 在转录过程中，转录因子通过DNA 结合结构域特 异识别并结合目标基因的特异调控序列，通过转录激 活结构域调节或将转录作用因子募集至启动子从而启 始基因的转录和表达。因此，提高宿主细胞转录因子 的表达水平也能增强目的基因的表达。
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•（4）MDCK细胞 • 该细胞是从成年雌性的西班牙长耳狗的肾脏分离获得 ，是具有贴壁依赖性的上皮样细胞，已成功地在微载体 上增殖。该细胞能支持多种病毒的增殖，已被用来生产 兽用疫苗。 •（5）Namalwa细胞 • 该细胞是一株人的类淋巴母细胞,来自名为 “Namalwa”的Burkitt淋巴瘤患者，含有部分疱疹病毒 基因，但不产生疱疹病毒。该细胞已被批准用于大规 模生产α干扰素，可以用无血清培养基在悬浮状态下 高密度培养，可有效地表达外源基因。
第9章动物基因工程
•3. 整合位点的优化 •目的基因在细胞染色体上整合位点区域的状态对于目的 基因的表达与否、表达高低以及目的基因在宿主细胞中 的稳定性起着决定性的作用。只有那些整合位点处于染 色体转录活跃区的细胞形成的克隆才可高水平表达目的 基因。因此，保证将表达载体整合在 细胞染色体上转录 活跃位点的克隆被挑选出来，是提高细胞表达水平必需 的一步，主要通过以下几种策略实现。
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•第一节 动物细胞基因工程
• 采用哺乳动物细胞的蛋白表达具有以下主要优点： •①哺乳动物细胞能识别和除去外源基因的内含子，剪接 加工成成熟的mRNA； •②哺乳动物细胞表达的蛋白质与天然蛋白的结构、糖基 化类型和方式几乎相同且能正确组装成多亚基蛋白，加工 后的蛋白质免疫原性好，约为酵母型的16~20倍； •③哺乳动物细胞易被重组DNA质粒转染，具有遗传稳定 性和可重复性； •④经转化的哺乳动物细胞可将表达的产物分泌到培养基 中，提纯工艺简单，成本低。
第9章动物基因工程
•一、动物细胞表达体系 • 动物细胞表达系统主要由宿主细胞和表达载体两部 分组成。 •1 表达载体 • 目前常用的表达载体分为病毒载体与质粒载体。病毒 载体是以病毒颗粒的方式，通过病毒包膜蛋白与宿主细胞 膜的相互作用使外源基因进入宿主细胞内。常用的病毒载 体有 ： •（1）逆转录病毒（Retrovirus）载体 •（2）腺病毒（Adenovirus，AV）载体 •（3）腺相关病毒（Adeno-associated Virus，AAV）载 体 •（4）质粒载体
第9章动物基因工程
•（6）Vero细胞 • 该细胞是从正常的成年非洲绿猴肾分离获得的， 一株具有贴壁依赖性的成纤维细胞。可持续地进行细 胞培养，并可支持多种病毒的增殖并制成疫苗 。 •（7）鼠骨髓瘤细胞 • 骨髓瘤细胞是“专业”的分泌细胞，在培养上清中 可产生高达100mg/L的免疫球蛋白（Ig），而且容易转 染，容易生长，可在无血清培养基中高密度的悬浮培 养；能对蛋白质进行糖基化修饰；高效表达Ig基因的 调控成分明确，有利于表达载体的增强子和启动子的 合理设计。
第9章动物基因工程
•二、动物细胞表达载体的构建 • 目的基因在哺乳动物细胞中的表达受整合目的基因的染 色体区域的状态、目的基因的拷贝数及目的基因的转录、 翻译和翻译后加工修饰效率的影响。构建一个高效表达的 哺乳动物细胞表达载体，应从表达载体在染色体上整合位 点的优化，转录翻译效率的提高以及目的基因拷贝数的增 加等方面综合考虑。下面分别从转录水平和翻译水平的调 控元件、整合位点的优化以及增加目的基因拷贝数等方面 对此作一介绍。
第9章动物基因工程
•（8）COS细胞 • 该细胞是利用复制起点缺失的SV40转染非洲 绿猴肾细胞CV-1而获得，具有COS-1、-3、和-7三 个细胞系。由于COS细胞来源广，易培养，易转染； 能组成性表达SV40大T抗原，能使大多数哺乳动物 细胞携带有复制子的质粒以附加体形式高拷贝扩增； 大量扩增的质粒及其高表达的mRNA和蛋白质，容 易回收和分析，因此被广泛地用于瞬时表达系统。
第9章动物基因工程
• 2 宿主细胞 • 虽然至今批准的由动物细胞表达的产品，其宿主细胞 几乎都是CHO细胞。但是在实践中，人们发现它也存在着 一些不足， • 因此，近来一些具有良好特征的细胞系都已被作为宿 主细胞试用于真核细胞的表达系统中。 •（1）BHK-21细胞 • 该细胞最早从地鼠幼鼠的肾脏分离，现在广泛应用的 是采用单细胞分离技术经13次克隆的细胞。原始的细胞 株是成纤维样细胞，并且具有贴壁依赖性，但经无数次 传代后细胞可悬浮生长。
第9章动物基因工程
• 2. 翻译水平 • 除了转录水平的调控外， 翻译水平的调控和翻译产 物的加工修饰的效率等也对目的基因的表达产生重要 的影响。Ploy（A）的存在不但能影响mRNA稳定性， 而且也能部分起“翻译增强子”的作用，提高mRNA 翻译水平；内部核糖体进入位点（IRES）能使同一 mRNA中除第1个基因之外的其他基因也得到有效表达 ；翻译增强子可提高翻译效率；通过使用宿主细胞偏 好的密码子来对目的基因的密码子进行优化也可以大 幅度提高翻译效率。
第9章动物基因工程
•（2）CHO-K1细胞 • 该细胞是CHO细胞的一株缺乏二氢叶酸还原酶（dhfr— ）的营养缺陷突变株，它可以在氨甲蝶呤(MTX）压力下 使外源基因的基因拷贝数扩增，使外源蛋白质得到较高水 平表达。 •（3）C127细胞 • 该细胞来自RIII 小鼠乳腺肿瘤细胞，适用于带有牛 乳头瘤病毒（BPV）载体的转染。当用BPV-1病毒载体 转染后，细胞的生长形态可发生显著变化，因此转染 成功的细胞可通过特有的转化形态加以识别。