TUNEL实验步骤
Tunel染色步骤
Tunel染色步骤染色是生物学实验中常用的一种技术手段，它可以标记和可视化细胞或组织中的特定分子或结构。
TUNEL（TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling）染色技术是一种常用于检测细胞凋亡的方法。
以下是TUNEL染色的步骤：准备工作：1.去离子水：除去离子，避免离子干扰反应。
2. 去氧核酸酶（DNase）的酶标：新鲜制备，如购买的DNase酶标已开封或保存时间较长，需要用氧化热焓（将无水乙酸用过氧化氢气化后灭菌）处理一晚才可以使用。
步骤一：样本固定1.取细胞或组织样本，放入离子缺失的缓冲液中，使其完全被液体覆盖。
2. 加入4%的 paraformaldehyde（或其他细胞或组织固定液），室温下固定10-15分钟。
3.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。
4.用细胞色素染色法染色检测固定细胞总蛋白质。
步骤二：处理样本1. 将细胞或组织样本渗透处理：将固定的细胞或组织置于PBS中含有0.5% Triton X-100（或0.1-0.2%的Bis-vinylsulfonyl] ethane等亲水试剂）的溶液中，室温下渗透30分钟。
2.将样本漂洗3次，每次10分钟，使用冷PBS漂洗。
3. 用DNase酶标法探测样本中DNA裂解。
步骤三：TUNEL反应1.取TUNEL反应液，根据实验需要，在冷冻时保持在冰上。
2.用比色皿将样本恢复到PBS中，将足量的TUNEL反应液加入标本中，使标本完全浸润，尽量避免气泡。
3.在37℃下孵育1-2小时。
步骤四：反应终止1.将标本移至冷藏，室温下用PBS漂洗3次，每次10分钟。
2.用缓冲液漂洗标本3次，每次10分钟。
步骤五：可视化与分析1.在镜下放置标本。
2.加入螢光抑制剂或DAPI等染料，使用荧光显微镜检测标本。
总结：TUNEL染色技术是一项用于检测细胞凋亡的重要方法。
它通过检测DNA的断裂末端来间接检测细胞凋亡。
整个TUNEL染色过程包括样本固定、样本处理、TUNEL反应、反应终止和可视化与分析等步骤。
tunel法检测细胞凋亡实验步骤
tunel法检测细胞凋亡实验步骤细胞凋亡是一种重要的生物学过程，它在多种生理和病理情况下发挥着关键作用。
为了研究细胞凋亡的机制和调控，科学家们发展了多种方法来检测细胞凋亡。
其中一种常用的方法是使用tunel法。
本文将介绍tunel法检测细胞凋亡的实验步骤。
实验步骤如下：1. 细胞培养和处理我们需要选择一种适合的细胞系进行实验。
常用的细胞系有HEK293、HeLa和Jurkat等。
将细胞培养在含有适当培养基和补充物的培养皿中，并在37摄氏度、5%二氧化碳的培养箱中培养至细胞密度适当。
在进行实验之前，需要根据实验设计的需要处理细胞。
例如，可以给予细胞不同的处理，如药物刺激、放射线照射或感染病毒等。
2. 固定细胞将处理后的细胞用适当的缓冲液进行固定。
常用的缓冲液有4%的乙醛或4%的甲醛等。
将缓冲液加入培养皿中，使细胞完全覆盖，并在室温下固定15分钟。
3. 洗涤细胞将固定的细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤3次，每次5分钟。
洗涤的目的是去除固定液中的残留物质，以减少后续步骤中的非特异性背景。
4. 使细胞透膜使用蛋白酶K或蛋白酶XXIV等酶将细胞膜上的蛋白质降解，使细胞透膜。
将适量的酶加入细胞中，根据实验的需要，可以调整酶的浓度和作用时间。
一般来说，酶的浓度为20μg/ml，作用时间为30分钟。
5. tunel反应使用tunel试剂盒进行细胞凋亡检测。
tunel试剂盒中含有标记有荧光物质的dUTP，可以与DNA断裂的末端结合。
按照试剂盒说明书的要求，将tunel试剂加入细胞中，与细胞中的DNA断裂末端发生连接反应。
反应时间一般为1-2小时。
6. 洗涤和染色将反应结束后的细胞用PBS洗涤3次，每次5分钟。
然后，可以选择使用荧光染料（如DAPI）染色，以标记细胞核。
将染色液加入细胞中，孵育15分钟后再次用PBS洗涤。
7. 显微镜观察和图像获取将处理后的细胞放置在显微镜载玻片上，并使用合适的显微镜观察细胞。
可以调整显微镜的放大倍数和焦距，以获得清晰的图像。
Tunel染色实验-检测细胞凋亡
Tunel染色操作流程及步骤：实验准备：1、固定溶液：4%的聚甲醛。
2、封闭溶液：3%H2O2的甲醇溶液，共计4ml。
其中30%H2O2 ：甲醇为1:9即：400ul30%H2O2+3.6ml甲醇。
3、透化溶液：0.1g柠檬酸+100mlddH2O+100ulTriston[1]。
实验步骤：1、磷酸盐缓冲液（PBS）洗3次每次5min[2-3]。
2、固定溶液：4%的聚甲醛固定1h[3-5]。
3：PBS洗4次每次7min[3]。
以下步骤全部避光:4、在15-25℃下与封闭溶液200ul孵育10min[3,6]。
5、PBS洗4次每次7min[3]。
6、透化溶液5min（4℃摇床）。
7、PBS洗4次每次7min[3]。
8、tunel溶液配制瓶1：瓶2=1:9（遮光），每孔加200mltunel混合物孵育60min[3,7] 。
8、PBS洗4次每次7min[3]。
9、加DAPI 200ml 15min[3,8]10、PBS洗4次每次7min[3]。
11、荧光显微镜拍片。
待学习…心得体会及注意事项：1、因柠檬酸量太少直接配制所需溶液量误差较大所以配制100ml体系。
2、洗去培养液。
3、加完液后放在摇床上。
4、每孔加200ul4%的聚甲醛。
5、为防止细胞聚集成团，宜在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动的同时进行固定。
6、封闭细胞内的氧化酶。
7、染凋亡细胞的DNA。
8、DAPI即4',6-二脒基-2-苯基吲哚(4',6-diamidino-2-phenylindole)，能够与DNA强力结合的荧光染料，用于荧光显微镜对比观测。
所有细胞DNA均可染色。
目的及原理目的：检测细胞凋亡原理：TUNLE染色即原位末端转移酶标记技术。
凋亡细胞的DNA双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3′-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶作用下，将脱氧核糖核苷酸和生物素所形成的衍生物标记到DNA的3′末端，从而进行凋亡细胞的检测。
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤精
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤精TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling）细胞凋亡试剂盒是一种常用的检测细胞凋亡的方法。
本文将介绍TUNEL细胞凋亡试剂盒的内容及操作步骤。
1.引物溶液：含有dUTP（脱氧尿苷三磷酸）的荧光标记的核苷酸。
2.终止缓冲液：用于停止反应和洗涤。
3. TUNEL酶溶液：含有DNA连接酶（terminal deoxynucleotidyl transferase），用于在DNA断裂的末端添加dUTP标记。
4.正对照组：包括经过DNA内切酶处理的组织切片或细胞，用于确定试剂盒的反应情况。
步骤一：取材将需要检测的组织切片或细胞标本取出，放入离心管或培养皿中。
步骤二：固定用4%的冷乙醇或4%的帕拉醛对组织切片或细胞标本进行固定，固定时间为10-30分钟。
步骤三：洗涤用PBS（磷酸盐缓冲液）洗涤固定的样本3次，每次洗涤5分钟。
步骤四：蛋白酶消化对组织切片或细胞标本进行蛋白酶消化，以去除背景蛋白质干扰。
消化时间和消化酶的浓度需要根据实验条件进行优化。
步骤五：洗涤用PBS洗涤样本3次，每次洗涤5分钟。
步骤六：加入TUNEL酶溶液将TUNEL酶溶液滴加到样本上，保持湿润。
反应时间为1-2小时，可以根据实验需要进行优化。
步骤七：终止反应加入终止液停止反应，并用PBS洗涤样本3次，每次洗涤5分钟。
步骤八：显微镜观察将样本用荧光或显色试剂染色，然后用荧光显微镜或普通显微镜观察，并拍摄照片。
步骤九：分析数据使用图像分析软件对显微镜拍摄的照片进行图像分析，在感兴趣区域计算标记的细胞数量，并计算相对细胞凋亡率。
值得注意的是，在进行TUNEL细胞凋亡试剂盒检测时，需要根据实验需要进行优化，如反应时间、荧光染色时间、荧光强度测量等。
此外，为了准确地判断细胞中的凋亡现象，可以与其他细胞凋亡指标一起使用，如Annexin V染色、Caspase活性检测等。
TUNEL实验步骤
我的TUNEL实验步骤：
1. 二甲苯浸洗2次*5分钟
2. 梯度乙醇（100、95、90、80、70%）各浸洗1次*3分钟
3. 双蒸水浸洗1次*3分钟
4. 3%H2O2浸洗1次*10分钟
5. PBS漂洗2次*5分钟。
滤纸吸干周围液体，pbs尽量除干净。
6. 在湿盒中，用蛋白酶K工作液100ul处理组织，覆盖住样品区。
21~37℃ 15分钟左右。
7. PBS漂洗2次*5分钟。
滤纸吸干周围液体，pbs尽量除干净。
8. 在暗湿盒中，玻片滴加50ul TUNEL反应液，加盖玻片，37℃，1.5小时或更长。
阴性对照组仅滴加标记液50ul。
阳性对照组加DNase1
9. PBS漂洗3次*5分钟。
（此时可以滴加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞，激发波长450-500nm，检测波长515-565nm）。
10.玻片周围吸干PBS后，滴加50ul转化剂-POD于标本上，加盖玻片，暗湿盒中反应，37℃，30分钟。
11.PBS漂洗3次*5分钟，滤纸吸干周围液体，pbs尽量除干净。
12.加50ulDAB底物，25℃，10分钟（时间控制）。
应为浅棕色的背景（5分钟的时候拿一个片子观察，有无棕黄色小体）
13.PBS漂洗3次*5分钟，滤纸吸干周围液体，pbs尽量除干净。
14.苏木素复染。
几秒钟，自来水冲掉。
15.用HCL分化
16.梯度酒精脱水（70、80、90、95、100%）*3分钟
17.二甲苯浸洗2次*5分钟。
18.中性树胶封片观察。
TUNEL步骤
储存与运输条件试剂盒需用干冰运输并储存在-20℃非无霜冰箱中。
第一次融化后，终止缓冲液和复染用甲基绿需放于室温储存，封闭缓冲液需放于4°C 储存。
然而，再次冷冻后并不明显影响这些缓冲液的使用效果。
试剂盒组分（1）蛋白酶K（PROTEINASE K）：2mg/ml 的蛋白酶K 溶解在10mM Tris溶液中（pH8.0）；用来消化细胞，增加样本的通透性。
（2）5×TdT平衡缓冲液（5X TdT EQUILIBRATION BUFFER）：1 M Sodium Cacodylate，0.15 M Tris，1.5 mg/ml BSA，3.75 mMCoCl 2 ，pH 6.6；使用前需5 倍稀释。
（3）生物素片段末端标记反应混合物（Biotin-FragELTM LABELING REACTION MIX）：3 管；生物素标记和未标记的脱氧核糖核苷酸以最佳的比例混合，在末端脱氧核糖核苷酸转移酶（TdT酶）的作用下标记DNA 片段末端。
（4）终止缓冲液（STOP BUFFER）：0.5M EDTA，pH8.0。
（5）封闭缓冲液（BLOCKING BUFFER）：4% BSA 溶于PBS 溶液中。
（6）50×偶联物（50×CONJUGATE）：50×链霉亲和素标记过氧化物酶偶联物。
（7）DAB 片：HRP 底物，0.7mg/片。
（8）双氧水/尿素片：1.6mg/片。
（9）甲基绿：0.3%复染用甲基绿。
（10）HL-60 细胞阳性/阴性对照片：提供两张相似的固定细胞甩片，都是用0.5µg/ml 放线菌素 D 处理19 小时的HL-60 细胞，含有已诱导凋亡细胞和未凋亡细胞，可作为凋亡阳性和阴性对照。
注意：其他组分也在使用后尽快放回-20℃冰箱保存。
为了避免试剂损失，使用前可以低速短暂离心融化后的试剂，然后小心开管取用。
Materials Required but not provided实验需用到的仪器耗材有：光学显微镜、小型染色缸、湿盒（塑料/玻璃容器与吸水纸）、冰盒、洗瓶、盖玻片、封口膜、各种规格的移液器及枪头等。
tunel 染色原理
tunel 染色原理
引言概述：
Tunel染色是一种常用的细胞学技术，用于检测细胞凋亡。
通过检测DNA断裂末端的3'-OH基团，Tunel染色可以准确地识别凋亡细胞，并在细胞核内形成明亮的荧光信号。
本文将详细介绍Tunel染色的原理，包括染色步骤、染色反应的机理、染色结果的解读以及其在研究中的应用。
正文内容：
1. Tunel染色的步骤
1.1 细胞固定和透化
1.2 凋亡诱导
1.3 染色反应
1.4 洗涤和封片
1.5 观察和分析
2. Tunel染色的机理
2.1 DNA断裂
2.2 TdT酶介导的标记
2.3 荧光探针的结合
2.4 染色信号的放大
2.5 荧光显微镜观察
3. Tunel染色结果的解读
3.1 正常细胞
3.2 凋亡细胞
3.3 背景噪声
3.4 阳性对照和阴性对照
3.5 图像分析和数据统计
4. Tunel染色在研究中的应用
4.1 细胞凋亡机制研究
4.2 肿瘤治疗效果评估
4.3 神经退行性疾病研究
4.4 肝脏损伤评估
4.5 胚胎发育研究
总结：
Tunel染色是一种可靠而广泛应用的细胞学技术，通过检测细胞凋亡的DNA断裂末端，可以准确地识别凋亡细胞。
在实验中，正确的染色步骤和机理的理解对于获得准确的结果至关重要。
Tunel染色在细胞凋亡机制研究、肿瘤治疗效果评估、神经退行性疾病研究、肝脏损伤评估以及胚胎发育研究等领域都具有重要的应用价值。
通过深入了解和熟练掌握Tunel染色的原理和操作技巧，我们可以更好地应用这一技术来推动相关领域的研究进展。
tunel细胞凋亡率计算
tunel细胞凋亡率计算摘要：1.细胞凋亡简介2.计算tunel 细胞凋亡率的方法3.tunel 细胞凋亡率计算的实验步骤4.结果与分析5.总结正文：细胞凋亡是细胞程序性死亡的一种方式，它在生物体的生长、发育、组织修复等过程中起着重要作用。
准确地计算细胞凋亡率对于研究细胞凋亡的机制和调控具有重要意义。
tunel 法是一种常用的检测细胞凋亡的方法，通过特定的试剂和仪器，可以定量地检测细胞凋亡的情况。
计算tunel 细胞凋亡率的方法主要包括以下几个步骤：（1）取样：从实验组和对照组中分别取出等量的细胞；（2）固定：将细胞用固定液固定，使细胞内的核酸不易分解；（3）切片：将固定后的细胞进行切片处理；（4）透化：用透化液将细胞膜通透化，使核酸标记物能够进入细胞；（5）标记：用特定的核酸标记物（如TUNEL 试剂）标记细胞内的核酸；（6）洗涤：用洗涤液将细胞内的非特异性标记物去除；（7）检测：用特定的仪器检测细胞内的标记物；（8）统计：根据检测结果计算细胞凋亡率。
实验过程中，需要注意以下几点：（1）确保实验组和对照组的细胞数量、状态一致；（2）固定液的浓度、处理时间等因素会影响细胞凋亡的检测结果，需严格控制；（3）切片处理要均匀，避免细胞破损；（4）透化时间和温度要严格控制，避免影响标记效果；（5）洗涤要充分，去除非特异性标记物。
通过以上方法，可以得到tunel 细胞凋亡率的数据。
这些数据可以反映细胞凋亡的程度，为研究细胞凋亡的机制和调控提供依据。
需要注意的是，实验结果可能会受到多种因素的影响，因此需要在统计分析时考虑这些因素，确保结果的准确性。
总之，计算tunel 细胞凋亡率是研究细胞凋亡的一种重要方法。
tunel细胞凋亡率计算
tunel细胞凋亡率计算
摘要：
1.细胞凋亡的概念
2.细胞凋亡率计算的方法
3.Tunel 细胞凋亡率计算的应用
正文：
细胞凋亡是细胞在生命周期中自然死亡的过程，对于生物体生长、发育和维持内环境稳定具有重要意义。
Tunel 细胞凋亡率计算是一种常用于检测细胞凋亡的方法，通过特定的染色技术，对细胞凋亡进行定量分析。
细胞凋亡率计算的方法有很多种，其中Tunel 法是一种较为常用的方法。
它是通过检测细胞内的DNA 断裂来判断细胞是否发生凋亡。
具体操作步骤如下：
(1) 固定细胞：将细胞固定在载玻片上，以保持细胞形态。
(2) 切片：对固定后的细胞进行切片，以便于观察。
(3) 脱脂：用脱脂剂去除细胞内的脂质，以降低背景干扰。
(4) 透化：用Tunel 试剂盒中的透化剂使细胞膜通透，使染色剂能够进入细胞内。
(5) 染色：将细胞内的DNA 断裂部位与荧光染料结合，使细胞内的凋亡信号得以显现。
(6) 封片：将载玻片封片，防止荧光染料挥发和褪色。
(7) 观察与拍照：在荧光显微镜下观察细胞，并记录观察结果。
通过以上步骤，可以对细胞凋亡率进行计算。
Tunel 细胞凋亡率计算在生物医学领域有广泛的应用，如研究细胞凋亡与疾病的关系、药物筛选、生物制品质量控制等。
tunel实验方法部分
(1)心肌组织固定：选取实验组心肌组织，切下心脏相同位置的绿豆粒大小一块心肌，展开放入包埋筐，将包埋筐浸没于4%多聚甲醛中24h~48h。
(2)脱水处理：根据心肌组织大小，选取合适的时间。
将包埋筐按照顺序分别浸没于75%乙醇1小时，80%乙醇1小时，95%乙醇1小时，无水乙醇Ⅰ1小时，无水乙醇Ⅱ1小时，二甲苯与无水乙醇1：1配制溶液30分钟，二甲苯Ⅰ30分钟，二甲苯Ⅱ30分钟。
(3)浸蜡处理：将经过脱水处理后的组织按照顺序分别浸没于石蜡Ⅰ45分钟，石蜡Ⅱ45分钟，石蜡Ⅲ1小时30分钟，取出包埋筐此时组织呈深褐色，坚固有光泽。
(4)组织包埋：采用徕卡包埋机（机器型号有待确认），将组织从包埋筐中取出，放置于铁质包埋盒底部，滴加液体石蜡，浸没组织，待液体石蜡液面离包埋盒顶部2-3毫米时停止滴加，放置到4度冰箱过夜。
(5)组织切片：将含组织的蜡块与包埋盒分离，采用徕卡切片机（机器型号有待确认），将蜡块底部有组织区域切成较小的正方形，放置于切片机固定蜡块处，将组织切成5微米的组织切片。
(6)展片，捞片和烤片：将组织切片放置于40度水浴锅中，用镊子轻轻将组织展开没有重叠区域，3-5min后用多聚赖氨酸处理过的带有正电荷的切片将组织捞起，放置于常温下将其沥干，然后放置于56度的烤箱中烤片2小时（增强组织的牢固性），取出将切片放入4度冰箱储存。
(7)(8)采用promega公司提供的DeadEnd™ Colorimetric TUNEL System试剂盒(9)1.常规脱蜡(10)将石蜡切片放置于60摄氏度水浴30min（增强组织的牢固性），将切片置于染色缸中，用二甲苯洗两次，每次10分钟（尽可能将石蜡完全脱掉，防止对后续实验影响），用无水乙醇洗两次，每次4min。
用 95%乙醇，80%乙醇和75%酒精各洗一次，每次4min。
用0.85%的NaCl溶液洗5min，再用PBS溶液洗5min。
(11)2凋亡检测(12)将组织切片放入盛有4%多聚甲醛的染色缸中洗15min，再用PBS洗5min。
TUNEL 法测凋亡操作步骤
TUNEL 法测凋亡操作步骤一、TUNEL检测原理TUNEL 细胞凋亡检测试剂盒是采用非同位素方法来检测细胞在凋亡过程中DNA 的断裂情况，可在原位快速准确地检测单个凋亡细胞。
本试剂盒适用于组织样本（石蜡包埋、冰冻和超薄切片）和细胞样本（细胞涂片）的凋亡原位检测。
其原理是细胞凋亡发生时，内源性核酸酶激活，使DNA的双链断裂或一条链出现缺口，产生一系列3’-OH末端，在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）作用下，组织细胞原位DNA切口可被标记上生物素-dUTP，即TUNEL（Terminal deoxynucleotidyl TransferaseBiotin-dUTP Nick End Labeling），可与连接了的辣根过氧化酶的链霉亲和素（Streptavidin-HRP）特异结合，在辣根过氧化酶底物二氨基联苯胺（DAB）的存在下，显示为棕色（过氧化物酶活性），特异准确地定位正在凋亡的细胞，在普通显微镜下即可观察和计数凋亡细胞；由于正的或正在增殖的细胞几乎没有DNA 的断裂，因而没有3'-OH 形成，很少能够被染色。
二、试剂盒组份组份10 assays25 assays 储存条件A：Equilibration Buffer 1.0 mL 2.5 mL -20 ℃B：Biotinylated Nucleotide Mix 10 μL 25 μL -20 ℃C：TdT Enzyme 10 μL 25 μL -20 ℃D：500×Proteinase K 10 μL 25 μL -20 ℃20×SSC 15 mL 38mL 4 ℃E：Streptavidin-HRP 10 μL 25 μL 4 ℃F：20×DAB Substrate Buffer 50 μL 125 μL 4 ℃G：20×DAB Chromogen 50 μL 125 μL 4 ℃H：20×Hydrogen Peroxide 50 μL 125 μL4 ℃三、操作流程1.操作流程概览2.细胞样本制备准备：● PBS：8.0g NaCl， 0.2 g KCl， 1.44g Na2HPO4，0.24g KH2PO4，溶于800ml去离子水中，HCl调pH至7.4，加水定容至1L。
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤
TUNEL细胞凋亡试剂盒内容及操作步骤一、试剂盒内容2.终止缓冲液：用于停止DNA链的合成反应，防止假阳性结果的产生。
3.蛋白酶K：用于溶解细胞质膜和核膜，使DNA暴露出来。
4.异硫氰酸荧光素（FITC）标记转移酶：用于检测dUTP与DNA标记的连接。
5.正控组织切片或细胞悬液：用于检验试剂盒的敏感性和特异性。
二、操作步骤1.细胞处理将要测试的细胞分成实验组和对照组，分别处理。
实验组是要测试凋亡的细胞，对照组是不会凋亡的细胞。
2.固定细胞用4%的乙醛或无氧乙醛等适当浓度的固定液固定细胞。
涂片上的细胞需要进行细胞穿孔，可以使用0.1%的Triton X-100进行细胞穿孔。
3.蛋白酶K消化将蛋白酶K溶解在PBS缓冲液中，加入溶液中胶原酶和蛋白酶蚀解，接着加入盛有细胞的离心管中。
将离心管放入37℃恒温水浴中，反应20-30分钟。
4.清洗细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。
5.脱水将细胞离心，抽去PBS缓冲液，然后使用3%的过氧化氢来进行脱水。
6.TUNEL染色将细胞加入等量的TUNEL试剂液，轻轻混合后，将离心管放入37℃恒温水浴中，反应30-60分钟。
7.洗涤细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。
8.反应终止使用终止缓冲液反应终止DNA链合成反应，将离心管放入室温中静置10分钟。
9.洗涤细胞用PBS缓冲液洗涤细胞3次。
每次用PBS缓冲液冲洗细胞5分钟。
10.展片与观察将细胞滴在载玻片上，并加入封片缓冲液。
在载玻片上覆盖盖玻片，用显微镜观察。
通过上述步骤，可以使用TUNEL细胞凋亡试剂盒对细胞进行凋亡分析。
该试剂盒可根据DNA末端的3'-OH羟基与终止缓冲液中标记的dUTP之间的连接，用显微镜观察细胞内是否存在凋亡现象。
荧光标记的dUTP可通过荧光显微镜直接观察，而酶标记的dUTP则需要加入相应的底物，通过酶的催化反应后可通过光学密度法或荧光显微镜来定量测定。
tunel法检测流程
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TUNEL联合免疫组化方法
TUNEL联合免疫组化的实验步骤一步法TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(红色荧光)1、常规程序制备石蜡组织块和5 wm厚石蜡组织切片。
2、然后按照TUNEL原位细胞凋亡检测试剂盒的标准步骤进行TUNEL染色。
对于石蜡切片：a. 二甲苯中脱蜡5-10分钟。
换用新鲜的二甲苯，再脱蜡5-10分钟。
无水乙醇5分钟。
90%乙醇2分钟。
70%乙醇2分钟，蒸馏水2分钟。
b. 滴加20µg/ml不含DNase的蛋白酶K，20-37℃作用15-30分钟(不同组织的最佳作用温度和时间需自行摸索)。
c. 用PBS或HBSS洗涤3次。
注意：这一步必须把蛋白酶K洗涤干净，否则会严重干扰后续的标记反应。
d. 在用PBS配制的3%过氧化氢溶液(3% H2O2 in PBS)中室温孵育10分钟，以灭活切片内源的过氧化物酶。
随后用PBS或HBSS洗涤3次。
注：请勿在用PBS配制的3%过氧化氢溶液中孵育过长时间，否则会出现过氧化氢导致的DNA断裂，从而产生假阳性。
e. 配制生物素标记液：参考下表配制适量的生物素标记液，需充分混匀。
注意：配制好的生物素标记液必须一次使用完毕，不宜冻存。
f. 样品的生物素标记：1. 在样品上加50µl 生物素标记液，37℃孵育60分钟。
注意：孵育时需注意在周围用浸足水的纸或药棉等保持湿润，以尽量减少生物素标记液的蒸发。
2. 用PBS或HBSS洗涤1次，滴加0.1-0.3ml标记反应终止液，室温孵育10分钟。
3. 用PBS或HBSS洗涤3次。
g. Streptavidin-HRP工作液和DAB显色液的配制： a. Streptavidin-HRP工作液的配制：参考下表配制适量的Streptavidin-HRP工作液，需充分混匀。
注意：配制好的Streptavidin-HRP 工作液必须一次使用完毕，不宜冻存。
h. DAB显色液的配制：按照每个样品使用0.2-0.5ml显色液的比例配制适量DAB显色液。
Tunel法应用、实验步骤及注意事项
Tunel法应用、实验步骤及注意事项Tunel是分子生物学与形态学相结合的研究方法，对完整的单个凋亡细胞核或凋亡小体进行原位染色，能准确地反应细胞凋亡典型的生物化学和形态特征，可用于石蜡包埋组织切片、冰冻组织切片、培养的细胞和从组织中分离的细胞的细胞形态测定，并可检测出极少量的凋亡细胞，因而在细胞凋亡的研究中被广泛采用。
Tunel法详细的实验步骤1. 常规方法制作石蜡切片，用二甲苯浸洗2次，每次5min;2. 用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次，每次3min;3. PBS漂洗2次;用Proteinase K工作液(20ug/ml)处理组织15-30 min 在21–37°C(温度、时间、浓度均需摸索)或者加细胞通透液8min;4. 加入含2%过氧化氢的PBS，室温反应5min，PBS漂洗2次5. 制备TUNEL反应混合液，处理组用50μl TdT+450μl 荧光素标记的dUTP液混匀;而阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液，阳性对照组先加入100μl DNase 1，反应在15~25℃×10min，后面步骤同处理组。
6. 玻片干后，用滤纸小心吸去切片周围多余液体，加50μl TUNEL 反应混合液(阴性对照组仅加50μl 荧光素标记的dUTP液)于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×1h。
7. 加入到已预热37℃的洗涤与终止反应缓冲液，37℃保温30min，PBS漂洗3次;8. 可以加1滴PBS在荧光显微镜下计数凋亡细胞(激发光波长为450~500nm，检测波长为515~565nm);9. 玻片干后加50μl DIG-POD于标本上，加盖玻片或封口膜在暗湿盒中反应37℃×30min。
10. PBS漂洗3次;在组织处加50~100μlDAB底物，反应15~25℃×10min;11. PBS漂洗3次;拍照后再用苏木素或甲基绿复染，几秒后立即用自来水冲洗。
TUNEL细胞凋亡检测(荧光标记)操作流程
一、TUNEL实验试剂(1)DeadEnd™Fluorometric TUNEL System试剂盒购自Promega公司(产品编号G3250)(2)二甲苯购自国药集团化学试剂有限公司（产品编号80139118，CAS号108-38-3，500ml）(3)无水乙醇购自中国上海生工生物有限公司（产品编号ET0737-500ml）(4) 过氧化氢购自上海生工生物有限公司(产品编号H1976-500ml)(5) Proteinase K购自上海生工生物工程技术服务公司(产品编号BSP169-2ml)(6)多聚甲醛购自上海生工生物有限公司（产品编号PB0684-500g）(7) Propidium iodide购自Sigma（产品编号P4170-10MG）(8) SlowFade® Gold antifade reagent购自Life Technologies（产品编号36936）二、具体实验步骤A. 石蜡包埋组织预处理：1.二甲苯5min (500ml二甲苯)2.二甲苯5min（500ml二甲苯）3.无水乙醇5min（500ml无水乙醇）4.无水乙醇5min（500ml无水乙醇）5.80%乙醇5min（500x0.8=400ml无水乙醇）6.70%乙醇5min（500x0.7=350ml无水乙醇）7.PBS 5min（500ml）8.PBS 5min（500ml）9.PBS 5min（500ml）10.4%多聚甲醛in PBS，15min11.PBS 5min（500ml）12.PBS 5min（500ml）13.Proteinase K in PBS (100ul每个样品，共6ml), 8-10min14.PBS 5min（500ml）15.PBS 5min（500ml）16.4%多聚甲醛in PBS，5min17.PBS 5min18.PBS 5min共105分钟，实际约2个小时B. 凋亡检测1.每个样品，100ul平衡缓冲液覆盖细胞，室温5-10分钟2.在平衡细胞的同时，在冰上解冻核苷混合物，并且依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应（见4.E节）的rTdT孵育缓冲液。
(完整版)TUNEL实验步骤
DeadEnd TM Colormetric TUNEL System1.概述 (1)2.产物成分及贮存条件 (3)3.测定法规程 (4)A．规程文献 (4)B．组织片段中细胞凋亡的分析步骤 (5)C．细胞培养中细胞凋亡的检测步骤 (7)D．阳性对照（随机）进行 (9)E．采用茴香霉素诱导的HL-60细胞凋亡的步骤 (9)4.故障循迹 (10)5.缓冲液和溶液的成分组成 (10)6.相关产物 (10)7.参考文献 (12)1.概述DeadEnd TM Colormetric TUNEL System 是一种非放射性系统，用于单个细胞水平上的平上的原位地简单、准确、快速的检测凋亡细胞。
TUNEL通过测量DNA的断裂片段（DNA断裂片段可以作为许多细胞类型的细胞凋亡的重要的生物化学指示因子），以此测定组织片段和培养细胞的凋亡死亡细胞。
高等真核生物的绝大多数细胞都能够通过一种内在细胞间的自杀程序（例如程序性细胞死亡和细胞凋亡）来进行自我灭亡。
细胞凋亡对于生物发育、内稳态和一些疾病十分重要。
细胞凋亡具有一些特定的形态学特征，包括泡状膜、细胞核和细胞质皱缩、染色体凝集。
细胞凋亡产生的细胞碎片通过胞膜联合形成凋亡小体，凋亡小体易被巨噬细胞和周围细胞吞噬和消化，并且不产生炎症反应。
这与类似细胞坏死的细胞死亡恰恰相反，其特征为细胞膨胀、染色体絮凝、膜完整性的缺失、细胞溶解和局部的炎症反应。
凋亡细胞中，在内源性核酸内切酶的作用下产生了DNA断裂片段，因此其细胞核中发生了形态学变化。
最具代表性地是，凋亡细胞的DNA被分为以180~200bp为单位长度的多聚体片段，这些片段易在琼脂糖凝胶形成梯度。
在外侧膝体核（LGN）、Fas抗体处理后的Jurkat细胞系(急性T细胞白血病细胞系)和茴香霉素处理后的HL-60细胞系中，采用轴突切断术诱导大鼠脑组织的神经死亡，并在振动切片机上切为组织片段，清晰地标记出凋亡细胞。
DeadEnd TM Colormetric TUNEL System在原位标记DNA断裂片段，并在所有系统中经过了证实。
TUNEL实验流程
一、实验原理细胞凋亡中染色体DNA的断裂是个渐进的分阶段的过程, DNA双链断裂或只要一条链上出现缺口而产生的一系列DNA的3’-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸化酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3’-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法一般称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（TUNEL）。
二、实验前要确认的东西（1）客户切片是否切好（2）切片上的编号是否与操作手册相符（3）客户要选用哪个公司的试剂盒以及试剂盒的量是否够用（4）试剂盒里不提供的东西我们是否有存货（5）实验中用到的试剂是否都已准备好三、操作流程（merk试剂盒）1、脱蜡和水合二甲苯Ⅰ 15min （二甲苯，生产商为国药，货号10023428, 规格500ml）二甲苯Ⅱ 15min二甲苯Ⅲ 15 min无水酒精 5 min（无水酒精，生产商为国药，货号10009218，规格500ml）无水酒精 5min95%酒精 5min75%酒精 5minTBS 漂洗，5min×3，小心干燥样品周围的玻片部分。
2、样品透性处理（1）用PH=8.0的Tris-hcl稀释蛋白酶K到20ug/ml（2）以100ul 20ug/ml的蛋白酶K完全覆盖组织，室温孵育20-30min（3）TBS 漂洗，5min×3,小心干燥样品周围的玻片部分。
3、灭活内源过氧化物酶（1）30％的H2O2用甲醇按1：10稀释到3%。
（30%的H2O2是国药的，货号10011208，规格500ml,甲醇是国药的，货号10014118，规格500ml）（2）以100ul 3% H2O2完全覆盖组织，室温孵育5min（3）TBS 漂洗，5m in×3,小心干燥样品周围的玻片部分。
4、平衡及标记反应（1 5xTdT平衡缓冲液用dh2O按1：5稀释（2）以100ul 1xTdT 平衡缓冲室温孵育10-30 分钟,同时准备标记反应混合物。
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DeadEnd TM Colormetric TUNEL System1.概述 (1)2.产物成分及贮存条件 (3)3.测定法规程 (4)A．规程文献 (4)B．组织片段中细胞凋亡的分析步骤 (5)C．细胞培养中细胞凋亡的检测步骤 (7)D．阳性对照（随机）进行 (9)E．采用茴香霉素诱导的HL-60细胞凋亡的步骤 (9)4.故障循迹 (10)5.缓冲液和溶液的成分组成 (10)6.相关产物 (10)7.参考文献 (12)1.概述DeadEnd TM Colormetric TUNEL System 是一种非放射性系统，用于单个细胞水平上的平上的原位地简单、准确、快速的检测凋亡细胞。
TUNEL通过测量DNA的断裂片段（DNA断裂片段可以作为许多细胞类型的细胞凋亡的重要的生物化学指示因子），以此测定组织片段和培养细胞的凋亡死亡细胞。
高等真核生物的绝大多数细胞都能够通过一种内在细胞间的自杀程序（例如程序性细胞死亡和细胞凋亡）来进行自我灭亡。
细胞凋亡对于生物发育、内稳态和一些疾病十分重要。
细胞凋亡具有一些特定的形态学特征，包括泡状膜、细胞核和细胞质皱缩、染色体凝集。
细胞凋亡产生的细胞碎片通过胞膜联合形成凋亡小体，凋亡小体易被巨噬细胞和周围细胞吞噬和消化，并且不产生炎症反应。
这与类似细胞坏死的细胞死亡恰恰相反，其特征为细胞膨胀、染色体絮凝、膜完整性的缺失、细胞溶解和局部的炎症反应。
凋亡细胞中，在内源性核酸内切酶的作用下产生了DNA断裂片段，因此其细胞核中发生了形态学变化。
最具代表性地是，凋亡细胞的DNA被分为以180~200bp为单位长度的多聚体片段，这些片段易在琼脂糖凝胶形成梯度。
在外侧膝体核（LGN）、Fas抗体处理后的Jurkat细胞系(急性T细胞白血病细胞系)和茴香霉素处理后的HL-60细胞系中，采用轴突切断术诱导大鼠脑组织的神经死亡，并在振动切片机上切为组织片段，清晰地标记出凋亡细胞。
DeadEnd TM Colormetric TUNEL System在原位标记DNA断裂片段，并在所有系统中经过了证实。
这本技术公报包含了检测组织切片和茴香霉素诱导处理的HL-60细胞的细胞凋亡的方法。
测定原则DeadEnd TM Colormetric TUNEL System 采用修饰的TUNEL末端标记凋亡细胞的DNA断裂片段。
通过使用末端脱氧核苷酸转移酶、重组子（rTdT）酶，将生物素化的核苷酸结合到DNA的3-OH末端。
辣根过氧化物酶（HRP）标记的链霉亲和素结合到生物素标记的核苷酸上，并使用过氧化物酶的作用底物、过氧化氢和稳定的铬精色原体二氨基联苯（DAB）进行检测。
使用这种方法，凋亡细胞的细胞核被染成深棕色。
2. 产物成分及贮存条件产物反应大小Cat#DeadEnd TM Colormetric TUNEL System 40 reactionsG7130包括：（辣根过氧化物酶结合的链霉亲和素）*9.6 mL Equilibration Buffer（平衡缓冲液）*40 uL Streptavidin HRP(0.5 mg/mL)*40 uL Biotinylated Nucleotide Mix(2×20uL) *200 uL DAB20×Chromogen（铬精色原体）(生物素标记核苷酸混合物) *200 uL DAB Substrate (底物) 20×Buffer*2×20uL Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, *200 uL Hydrogen peroxide 20×（过氧化氢）Recombinant (末端脱氧核苷酸转移酶，重组子) *40 Plastic Coverslips (塑料盖玻片)*70 mL SSC,20×*10 mg Proteinase K (蛋白酶K)产物反应大小Cat#DeadEnd TM Colormetric TUNEL System 20 reactionsG7130包括：*4.8 mL Equilibration Buffer（平衡缓冲液）*40 uL Streptavidin HRP(0.5 mg/mL)*20uL Biotinylated Nucleotide Mix(2×20uL) *200 uL DAB20×Chromogen(生物素标记核苷酸混合物) *200 uL DAB Substrate (底物) 20×Buffer*20uL Terminal Deoxynucleotidyl Transferase, *200 uL Hydrogen peroxide 20×Recombinant (末端脱氧核苷酸转移酶，重组子) *20 Plastic Coverslips (塑料盖玻片)*20 mL SSC,20×*10 mg Proteinase K (蛋白酶K)贮存条件：在-20 ℃下贮存平衡缓冲液、rTdT酶、生物素标记核苷酸混合物和蛋白酶K。
在4 ℃下贮存Streptavidin HRP、20×Buffer 的DAB底物、20×过氧化氢。
在室温条件下贮存20×SSC和塑料盖玻片。
○注本系统的不同成分具有不同的贮存条件。
在使用前，将系统提供的蛋白酶K在蛋白酶K缓冲液中重建。
在-20 ℃下贮存等份的重组的10mg/mL的蛋白酶K溶解液，在-20 ℃下酶的稳定性至少能保持6个月。
安全事项：平衡缓冲液包含二甲胂酸，避免接触皮肤和眼睛。
当使用这种试剂时，戴上眼镜和安全手套。
DAB可能是致癌物，当使用这种试剂时，戴上眼镜和安全手套。
3. 测定方法3.A 方法综述在使用DeadEnd TM Colormetric TUNEL System前，阅读以下材料。
提供给使用者的材料：* 磷酸盐缓冲生理盐水（PBS）* 0.3% 过氧化氢用于封闭内源性的过氧化物酶* 固定剂（例如，10%的缓冲甲醛，4%多聚甲醛，4%不包含甲醇的甲醛）* 封固剂○注不要使用系统提供的20×过氧化氢去准备用于封闭内源性过氧化物酶0.3%的过氧化氢溶解液。
培养细胞的附加材料：* 多聚-L-赖氨酸* 0.2% PBS溶解的Triton X-100* DNase-I（例如，RQ1 RNase-Free DNase,Cat#M6101）* DNase缓冲液石蜡包埋的组织切片的附加材料：* 二甲苯或者二甲苯替代物[例如Hemo-De 清除剂（FisherCat#15-182-507A）]* 去离子水稀释的乙醇（100%，95%，85%，70%和50%）* 0.85% NaCl溶液* 蛋白酶K缓冲液* DNase-I（例如，RQ1 RNase-Free DNase,Cat#M6101）* DNase 缓冲液组织切片和细胞培养的附加设备*多聚-L-赖氨酸包被或者硅烷化的显微镜玻片[例如，Poly-Prep 玻片（Sigma Cat#P 0425），重磨砂的玻璃玻片（Fisher Cat#12-550-15）或者其他预处理的玻片]* 玻片染色缸（需要一个单独的缸用于随意的DNase-I阳性对照玻片染色）* 钳状骨针* 微量移液器* 用于显微镜玻片的增湿箱* 玻璃盖玻片* 37℃的保温箱* 显微镜* 干净的指甲油和胶布3.B 组织切片中的凋亡细胞的分析步骤适用于组织切片的测定步骤需要很多方式准备，包括石蜡组织包埋的切片，冰冻切片和振动切片。
对于冰冻切片和振动切片，在第4步开始。
1.将石蜡包埋切片和脱蜡组织切片（贴敷于显微镜玻片上）置于染色缸中新鲜的二甲苯，室温浸没5 min。
重复1次本操作。
2.将玻片浸没在100%的乙醇中漂洗，室温5 min.3.重复浸没在100% 乙醇中漂洗3 min，将玻片连续地浸没在不同浓度梯度的乙醇中（95%，85%，70%，50%），室温，每种3 min，以此使样品再水化。
4.室温，浸没在0.85% NaCl，5 min。
5.室温，浸没在PBS，5 min6.固定组织切片：室温，浸没在4% 多聚甲醛或者10% 甲醛缓冲液中，15 min。
7.室温，浸没在PBS，5 min。
重复1次。
8.去除组织切片的水分，并将玻片置于平面上。
制备20 ug/mL的蛋白酶K：将10 mg/mL的蛋白酶K原液按1:500 的比例在PBS中稀释。
取100 uL的20ug/mL蛋白酶K加到每张玻片上，并将组织切片覆盖，室温培育玻片10-30min。
○注：蛋白酶K有助于组织的水分渗透，但是培育时间延长可能会使组织滑下玻片。
为了获得最佳结果，需要优化培育的时间。
较薄的组织切片（例如5-10 um的石蜡切片）培养时间较短，较厚的组织切片（例如50 um的振动切片）培育时间较长。
9.室温，浸没在PBS，5 min。
10.进一步固定组织切片：室温，浸没在4% 多聚甲醛或者10% 甲醛缓冲液中，5 min。
11.室温，浸没在PBS，5 min。
重复1次。
注意：准备阳性对照：用DNase I处理样品，从而生成DNA断裂片段。
DNase 的处理方法参见3.D。
12.敲击玻片以去除多余的水分。
用100 uL的平衡缓冲液覆盖细胞组织。
室温，平衡5-10 min。
13.切片平衡时，在冰上解冻生物素标记的核苷酸混合物，并制备足够的rTdT反应混合物，从而用于所有的实验组反应和对照组反应。
每张玻片加100 uL 的反应混合物，以足够覆盖组织切片。
rTdT 反应混合物的制备细节详见表1.表 1 rTdT 反应混合物的制备缓冲液成分每100 uL标准反应数组分体积反应的体积（实验组+阳性对照）平衡缓冲液98 uL ×__ =生物素标记的核苷酸混合物 1 uL × __ =rTdT 酶 1 uL × __ =至于阴性对照：制备不含rTdT酶的培育缓冲液：98 uL平衡缓冲液，1 uL生物素标记的核苷酸混合物和1 uL高压的去离子水。
通过以下14-24步骤的方法。
14.用面巾纸吸干平衡部分周围的水分，并加上100 uL的rTdI反应混合物到玻片的组织片段上。
不要让切片干燥了。
15.用塑料盖玻片盖上切片，以此保证试剂的分布。
37 ℃下，在增湿箱中培育玻片60 min，以保证发生末端反应。
16.用去离子水按1:10比例稀释20×SSC。
去除塑料盖玻片，终止反应：室温，浸没在2×SSC，15 min。
注意：在稀释前，确保20×SSC中的盐粒都溶解了。
17.室温下，浸没在新鲜的PBS中，5 min。
重复此漂洗，2次，以去除未结合的生物素标记的核苷酸。