重组人白细胞介素17A对结肠癌细胞生长的影响及其作用机制
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[文章编号] 1
671-587Ⅹ(2019)02-0258-04 DOI:10.13481/j
.1671-587x.20190208[收稿日期] 2018-11-
26[基金项目] 国家自然科学基金资助课题(81302226);吉林省科技厅科研基金资助课题(20130101164JC,
20140414059GH);吉林省教育厅科研基金资助课题(20132070,2014200,2015129);吉林省卫计委科研基金资助课题(104900496
)[作者简介] 杨学良(1974-),男,吉林省吉林市人,副主任医师,医学博士,主要从事消化道恶性肿瘤防治方面的研究。
[通信作者] 杨学良,副主任医师,硕士研究生导师(Tel:0432-
62166423,E-mail:13943243777@139.com)重组人白细胞介素17A对结肠癌细胞生长的影响及其作用机制
杨学良1,王明华1,刘艳波2,孙雪梅2,
3
,赵晓晖2,杨丽娟2,肖梓屾2(1.北华大学附属医院普通外科,吉林吉林132012;2.北华大学基础医学院病理生理学教研室,
吉林吉林132013;3.吉林省东丰县中医院急诊科,吉林东丰136300
)[摘 要] 目的:探讨重组人白细胞介素17A(IL-
17A)对结肠癌细胞生长的影响,并阐明其作用机制。
方法:将结肠癌SW480细胞分为对照组和实验组,对照组细胞未经处理,实验组细胞加入50μg·L-1
重组人
IL-17A。
采用CKK-8法检测2组SW480细胞增殖活性,采用ELISA法检测2组细胞中IL-17A水平,Westernblotting法检测2组SW480细胞中信号传导及转录激活因子3(STAT3)和磷酸化信号传导及转录激活因子3(p
-STAT3)蛋白表达水平。
结果:与对照组比较,实验组细胞增殖活性明显升高(P<0.05)。
与对照组比较,实验组SW480细胞中IL-17A水平、STAT3和p-STAT3蛋白表达水平明显升高(P<0.01)。
结论:重组人IL-17A可刺激结肠癌细胞SW480细胞的生长,其作用机制可能与激活STAT3信号通路有关。
[关键词] 人白细胞介素17A;结肠癌细胞;信号通路;信号传导及转录激活因子[中图分类号] R735.35 [
文献标志码] AEffect of recombinant human IL-17Aon g
rowth of coloncancer cells and its
mechanismYANG Xueliang1,WANG Ming
hua1,LIU Yanbo2,SUN Xuemei 2,3,ZHAO Xiahui 2
,YANG Lij
uan2,XIAO Zishen2
(1.Department of General Surgery,Affilicated Hospital,Beihua University,Jilin 132012,China;2.Dep
artmentof Pathophysiology,School of Basic Medical Sciences,Beihua University,Jilin 132012,China;3.Departmentof Emergency,Dongfeng Hospital of Chinese Traditional Medicine,Jilin Province,Dongfeng
136300,China)ABSTRACT Objective:To explore the effect of recombinant human interleukin-17AI(IL-17A)on the growth ofcolon cancer cells,and to investigate the related mechanism.Methods:The colon cancer SW480cells were dividedinto control group and experimental group.The SW480cells in control group
were untreated and the SW480cells inexperimental group
were added with 50μg·L-1
IL-17A.The proliferation abilities of SW480cells in two groupswere detected by
CKK-8method.The levels of IL-17Ain the SW480cells in two groups were detected by ELISA,and the expression levels of signal transducers and activators of transcription 3(STAT3)and p-signal transducersand activators of transcriptions 3(p-STAT3)were examined by Western blotting methed.Results:Compared withcontrol group,the proliferation ability of the SW480cells in experimental group was increased(P<0.05).Thelevel of IL-17Ain the SW480cells in experimental group was significantly
higher than that in control group(P<0.01).Compared with control group,the expression levels of STAT3and p-STAT3proteins in the SW480cells inexperimental group were significantly higher than those in control group(P<0.01).Conclusion:Recombinant8
52第45卷 第2期
2019年3月吉 林 大 学 学 报 (医 学 版)
Journal of Jilin University(
Medicine Edition)Vol.45No.2
Mar.2019
protein IL-17Acan stimulate the growth of colon cancer SW480cells,which may be related to the activation ofSTAT3signaling pathway.
KEYWORDS interleukin-17A;colon cancer cells;signal pathway;signal transducers and activators oftranscription
结直肠癌作为最常见的消化道恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率呈逐年升高的趋势,死亡率位于恶性肿瘤的第4位[1-2]。
白细胞介素17A(interleukin-17A,IL-17A)作为白细胞介素17(interleukin-17,IL-17)家族的重要成员之一,参与炎症反应过程,并且与机体的免疫功能及免疫细胞有密切关联[3-4]。
研究[5-9]显示:IL-17在多种恶性肿瘤,如肝癌、胃癌、结直肠癌、乳腺癌和卵巢癌等中表达水平均升高。
研究[10-13]显示:IL-17A可通过调节多种信号通路进而影响癌细胞的增殖、凋亡和侵袭能力,信号通路包含信号传导及转录激活因子3(STAT3)、磷脂酰肌醇三激酶(PI3K/AKT)和IL-17/酪氨酸激酶JAK2通路。
但目前国内外关于IL-17A对结肠癌增殖影响及其机制的研究少有报道。
本研究观察重组人IL-17A对结肠癌SW480细胞体外增殖能力的影响,并探讨其相关机制,为临床结肠癌的诊治和药物靶点的开发提供一定的理论依据。
1 材料与方法
1.1 细胞、主要试剂和仪器 结肠癌SW480细胞购自上海ATCC细胞库,细胞培养基(RPMI-1640)、胎牛血清、青-链霉素和0.25%胰蛋白酶(含EDTA)均为美国Hyclone公司产品,RIPA裂解液和BCA蛋白定量试剂盒购自北京康为世纪生物科技公司,重组人IL-17A为英国Abcam公司产品(货号:ab9567)(4℃只能保存1~2周,需保存于-20℃或-80℃,避免冻融循环),鼠抗STAT3(货号:#9139)、鼠抗p-STAT3(货号:#4113)和鼠抗GAPDH(货号:#97166)一抗为美国Cell Signaling Technology公司产品,二抗为中杉金桥公司产品,IL-17AELISA试剂盒购自杭州联科生物技术有限公司,ECL试剂盒为上海碧云天公司产品。
ThermoFisher酶标仪为美国赛默飞世尔Thermo Scientific公司产品,Bio-Rad仪器为美国伯乐电穿孔仪。
1.2 SW480细胞株体外培养 在RPMI-1640培养基中加入适量的胎牛血清和青-链霉素配置成含10%胎牛血清的细胞培养液,加入适量的SW480
细胞,放置于5%CO2、37℃细胞培养箱中培养,待细胞增殖至80%~90%时采用0.25%胰蛋白酶(含EDTA)进行消化并传代,选择对数生长期的细胞进行后续实验。
1.3 细胞增殖实验 将体外培养的SW480细胞分为对照组(未处理)和实验组(经IL-17A处理),将处于对数生长期的细胞接种于96孔板中,设置第1、2、3、4和5天共5组,每组设置3个复孔。
培养2~4h细胞贴壁后加入10μL的CKK-8试剂,轻轻敲击培养板混匀,继续培养2h,分别检测酶标仪450nm处的吸光度(A)值,以A值表示细胞的增殖活性,A值越大细胞增殖活性越强。
1.4 ELISA法检测SW480细胞中IL-17A水平 将处于对数生长期的细胞接种于6孔板,分为对照组(未处理)和实验组(经50μg·L-1 IL-17A处理,参考王庆生等[7]的方法),待细胞贴壁后加入适量胰蛋白酶消化,收集细胞悬液4℃、1 000g离心10min后弃掉培养液,加入预冷的PBS洗涤3次,加入适量的细胞裂解液(含蛋白酶抑制剂)进行重悬,于-20℃和-80℃反复冻融充分裂解,12 000g离心15min后,取上清。
采用ELISA试剂盒检测SW480细胞中IL-17A水平,具体操作按照说明书进行,重复3次实验。
1.5 Western blotting法检测SW480细胞中STAT3相关蛋白的表达 采用BCA试剂盒对2组细胞进行定量,配平后加入适量的5×Loadingbuffer后,100℃煮沸5min变性,制作SDS-PAGE凝胶,加入适量的变性蛋白进行电泳,电泳完成后将蛋白转至PVDF膜,采用3%的BSA液进行封闭,TBST液洗膜后按照1∶1 000的比例加入相应的一抗,4℃孵育过夜,TBST洗膜3次,按照1∶2 000加入二抗,孵育1h,TBST洗膜3次,按照ECL试剂盒进行曝光显色,重复实验3次,采用Image J软件计算各条带的灰度值,以条带的灰度值表示蛋白表达水平。
1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析。
2组SW480细胞的增殖活性、IL-17A水平和STAT3及p-STAT3蛋白表达水平以x±s表示,符合正态分布,组间比较采用两独
9
5
2
杨学良,等. 重组人白细胞介素17A对结肠癌细胞生长的影响及其作用机制
立样本t检验。
以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 CKK-
8法检测2组SW480细胞的增殖活性 实验组第2、3、4和5天时细胞增殖活性均高于对照组(P<0.05
)。
见表1。
2.2 2组SW480细胞中IL-
17A水平 采用ELISA法检测对照组和实验组SW480细胞中IL-
17A水平,结果显示:对照组和实验组SW480细胞中IL-
17A水平分别为(10.51±1.87)和(24.26±3.61)μ
g·L-1,2组比较差异有统计学意义(t=5.858,P=0.004
)。
表1 2组SW480细胞的增殖活性
Tab.1 Proliferation abilities of SW480cells in two group
s(n=3,x±s
)GroupProliferation ability
(t/d) 1
2
3 4
5
Control
0.224±0.008 0.354±0.011 0.464±0.061
0.630±0.091
0.863±0.029Test 0.234±0.009
0.455±0.017
0.635±0.019
0.862±0.020
1.075±0.031
t1.438 8.640 4.636 4.313 8.650P
0.224
0.001
0.009
0.013
0.001
2.3 2组SW480细胞中STAT3和p-
STAT3蛋白表达水平 与对照组比较,实验组细胞中STAT3和p-
STAT3蛋白表达量均升高;经过灰度分析,实验组细胞中STAT 3和p-
STAT 3蛋白表达水平明显高于对照组(P<0
.01)。
见图1和表2。
图1 2组SW480细胞中STAT 3和p-
STAT 3蛋白表达电泳图Fig.1 Electrophoregram of expressions of STAT3andp
-STAT3proteins in SW480cells in two groups表2 2组SW480细胞中STAT3和p-STAT3蛋白表达水平
Tab.2 Expression levels of STAT3and p
-STAT3proteinsin SW480cells in two group
s(n=3,x±s
)Group
STAT3p
-STAT3Control 0.241±0.018 0.225±0.014Exp
erimental 0.748±0.052
0.647±0.041
t15.96 16.87P
<0.
01<0.
01
3 讨 论
研究[14]
显示:结直肠癌的不良预后与恶性肿
瘤细胞的无限增殖和侵袭转移能力有密切关联。
研
究[15-
16]显示:慢性炎症与结直肠癌的发生密切相
关,可增加其发生的风险。
IL-
17A作为炎症因子之一,通过介导炎症反应参与恶性细胞的增殖、生长、分化和凋亡等各个过程,在肿瘤的微环境中起
重要作用[1
7]。
在健康人结肠黏膜细胞中IL-
17A水平很低,在慢性炎症和实体瘤组织中其水平明显升
高[1
8],但是IL-
17A在恶性肿瘤中的作用仍存在争议,IL-17A一方面可发挥抗肿瘤作用,抑制肿瘤生长,另一方面有促肿瘤作用,能够促进肿瘤细胞
的生成、侵袭和转移[1
9]。
由此可见,IL-
17A在肿瘤中有多种作用。
本研究采用IL-17A蛋白处理结肠癌SW480细胞,CKK-8法检测IL-17A对结肠癌SW480细胞增殖能力的影响,结果显示:实验
组细胞的增殖能力明显高于对照组。
同时本研究检测了2组SW480细胞中IL-17A水平,结果显示:经IL-17A处理后,SW480细胞中IL-17A水平明显升高,能够促进结肠癌细胞的增殖,提示IL-17A可作为结肠癌细胞增殖的促进因子。
STAT3信号通路通过介导多个生长因子和细
胞因子参与细胞的增殖、分化和凋亡过程,此信号的过度活化可引起细胞的异常增殖。
在多种肿瘤,如乳腺癌、胃癌和直肠癌等肿瘤组织中STAT3信
号通路激活明显[20-22]。
研究[23-
25]显示:IL-
17可通过激活STAT3信号通路影响细胞的增殖和上皮间质转化(epithelial-mesenchy
mal transition,EMT)。
XU等[26]
发现:IL-
17蛋白可通过激活STAT3信号通路参与胃癌细胞增殖;HUANG等[2
7]发现:
IL-
17可通过刺激STAT3信号通路促进肺腺癌细胞的EMT,但关于此信号通路与结肠癌关系的研究则少有报道。
本研究采用Western blotting法检测SW480细胞经IL-
17A处理后STAT3和06
2吉林大学学报(医学版) 第45卷 第2期 2019年3月
p-STAT3蛋白表达的变化,结果显示:STAT3蛋白表达水平明显升高,同时p-STAT3的表达水平也明显升高,由此可见,IL-17A可增加STAT3的表达水平,STAT3的激活与结肠癌增殖有关,提示IL-17A促进结肠癌细胞增殖可能与激活STAT3信号通路有关。
综上所述,IL-17A可能通过激活STAT 3信号通路促进结肠癌细胞的增殖,IL-17A促进结肠癌细胞增殖是否存在其他信号通路参与还需进一步研究。
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