HPLC梯度洗脱法测定伊曲康唑有关物质的方法研究

HPLC梯度洗脱法测定伊曲康唑有关物质的方法研究
张琳;袁雯玮;曹晓云
【摘要】目的建立高效液相色谱梯度洗脱法测定伊曲康唑的有关物质.方法采用反相高效液相色谱法,色谱柱为AlltechHypersil BDS (100mm×4.6mm,3μm);以0.02mol/L硫酸氢四丁基铵溶液为流动相A,乙腈为流动相B,进行线性梯度洗脱;流速为1.5mL/min;检测波长为225nm.结果伊曲康唑及各已知杂质、中间体均能达到基线分离,样品中各杂质及主峰的分离度和检测灵敏度均满足有关物质的测定要求.结论方法灵敏、准确,专属性强,可用于测定伊曲康唑的有关物质.
【期刊名称】《中国抗生素杂志》
【年(卷),期】2015(040)002
【总页数】4页(P112-115)
【关键词】伊曲康唑;有关物质;高效液相色谱法;梯度洗脱
【作者】张琳;袁雯玮;曹晓云
【作者单位】天津市药品检验所,天津300070;天津市药品检验所,天津300070;天津市药品检验所,天津300070
【正文语种】中文
【中图分类】R978.5
伊曲康唑为三唑类广谱抗真菌药，对深部真菌及浅表真菌均有抗菌作用，临床主要应用于深部真菌所引起的感染。

由于其临床疗效好、治愈率高，在较大剂量时可保证治疗的安全性，从而成为治疗深部真菌感染的理想选择，市场前景广阔。

比利时
杨森制药公司于1980年成功研制合成伊曲康唑，1982年其胶囊剂试用于临床，于1988年9月在墨西哥首次上市，1992年在美国获得FDA批准，1993年2月在我国上市。

国内文献中关于伊曲康唑有关物质的研究鲜有报道，随着伊曲康唑临床使用的增加和对其杂质谱的逐步了解，亟需建立适宜的有关物质测定方法以控制其质量。

2010年之前的中国药典各版均未收载伊曲康唑质量标准，国内各生产企业均采用试行标准或新药转正标准，以甲醇-醋酸铵-乙醚的流动相系统等度洗脱测定其有关物质。

国外药典中仅有EP和BP收载了该品种，以27.2g/L硫酸氢四丁基铵溶液和乙腈进行梯度洗脱测定有关物质，并在正文后列出其7个已知杂质结构[1-2]。

本文在方法研究之初从兼顾制剂的角度考虑，拟以相同系统同时测定伊曲康唑及其胶囊剂的有关物质，在参考EP/BP流动相系统的基础上，进一步研究改进，降低了供试品溶液的浓度和流动相中盐浓度、调整了梯度洗脱程序，并对系统适用性试验方法分离度试验用溶液进行了修改，建立了测定伊曲康唑有关物质的HPLC梯度洗脱方法。

本文所建立的方法灵敏、准确，专属性强，可同时使伊曲康唑及EP的7个已知杂质、4个原料中间体和伊曲康唑胶囊中的4个已知杂质均能达到基线分离，可同时用于伊曲康唑胶囊有关物质的测定，优于国内外其他同品种质量标准，有助于发现产品的质量问题，进而促进产品质量的提高。

1.1 仪器
Agilent 1200高效液相色谱仪(DAD检测器)和岛津LC-20A高效液相色谱仪。

1.2 试剂
硫酸氢四丁基铵≥99%(J&K Chemical Ltd.)，乙腈为色谱纯。

1.3 对照品及中间体
伊曲康唑对照品由中国药品生物制品检定所提供；伊曲康唑7个已知杂质对照品
和伊曲康唑胶囊4个杂质均为企业提供；伊曲康唑4个中间体由原料生产企业提供。

1.4 样品
伊曲康唑和伊曲康唑胶囊均为国内药厂产品。

2.1 色谱条件与系统适用性试验
采用A l l t e c h H y p e r s i l B D S色谱柱(100mm×4.6mm，3μm)；以
0.02mol/L硫酸氢四丁基铵溶液为流动相A，乙腈为流动相B，线性梯度洗脱(0～20min，A：80%→60%；20～25min，A：60%；25～30min，A：60%→50%；30～44min，A：50%；44～45min，A：50%→80%；45～50min，A：80%)；流速为1.5mL/min；检测波长为225nm；柱温为25℃。

取伊曲康唑对照品约
20mg，加甲酸1mL使溶解，于60℃水浴中加热3h，加甲醇-四氢呋喃(4:1)混合溶液稀释至10mL，摇匀，在室温条件下放置24h，得每1mL中约含2mg的伊
曲康唑与其降解杂质的混合溶液，取10μL注入液相色谱仪，记录色谱图。

其中与主峰相对保留时间为0.97与1.05处杂质峰的含量分别不少于0.1%与0.4%，伊
曲康唑峰的保留时间约为23min，伊曲康唑峰与其相对保留时间0.97与1.05处
杂质峰的分离度均大于1.5，见图1。

2.2 测定法
取本品适量，用甲醇-四氢呋喃(4:1)混合溶液溶解并稀释制成约含2mg/mL的溶液，作为供试品溶液；精密量取适量，加上述溶剂定量稀释制成约含10μg/mL的溶液，作为对照溶液。

取对照溶液10μL注入液相色谱仪，调节检测灵敏度，使主成分色谱峰的峰高为满量程的20%～25%；再精密量取供试品溶液与对照溶液各10μL，分别注入液相色谱仪，记录色谱图，供试品溶液色谱图中如有杂质峰，单
个杂质峰面积不得大于对照溶液主峰面积(0.5%)，各杂质峰面积的和不得大于对照溶液主峰面积的2.5倍(1.25%)。

(供试品溶液中任一小于对照溶液主峰面积0.1倍
的峰可忽略不计)
2.3 专属性考察
取伊曲康唑对照品、EP的7个杂质对照品、原料生产企业提供的4个原料中间体、制剂生产企业提供的伊曲康唑胶囊中的4个杂质对照品各适量，照上述溶液制备
方法制成伊曲康唑和杂质、中间体的混合溶液，采用上述色谱条件进样测试，伊曲康唑峰与相邻杂质分离良好，各杂质之间也基本达到有效分离，见图2。

实验结果表明该方法有较强的专属性。

2.4 线性关系考察
取伊曲康唑对照品适量，用甲醇-四氢呋喃(4:1)混合溶液溶解并定量稀释制成系列
浓度的溶液，进样测试，考察其线性范围。

结果表明，在2.03～101.6μg/mL浓
度范围内，伊曲康唑峰面积与溶液浓度呈良好的线性关系，线性方程为
Y=1.742×104X+5.73×103，r=1.0000。

2.5 灵敏度考察
取伊曲康唑对照品适量，用甲醇-四氢呋喃(4:1)混合溶液溶解并定量稀释制成
0.406μg/mL的溶液，进样测试，S/N大于3，该浓度约为供试品溶液的0.02%。

2.6 稳定性试验
伊曲康唑供试品溶液室温条件下放置0、1、2、4、6和8h时，分别进样测试，
有关物质检出结果基本一致，表明供试品溶液室温条件下放置8h内基本稳定。

2.7 有关物质测定结果与供试品溶液浓度的相关性
取伊曲康唑原料，分别按上述溶液制备方法制成1.6、2.0和2.4mg/mL不同浓度的供试品溶液和相应的0.5%的自身对照溶液。

分别依法测定，有关物质测定结果基本一致，表明供试品溶液在1.6～2.4mg/mL浓度范围内，有关物质测定结果受溶液浓度改变影响不大。

2.8 方法耐用性考察
取伊曲康唑原料1批，分别以条件①Ag ilent 1200高效液相色谱仪，Thermo Hypersil BDS色谱柱(100mm×4.0mm，3μm)和条件②岛津LC-20A高效液相色谱仪，Alltech Hypersil BDS色谱柱(100mm×4.6mm，3μm)考察方法的耐用性，结果见表1。

降解产物与主峰的分离度均符合要求，同批样品有关物质检查结果基本一致，说明所建立的方法耐用性较好。

2.9 样品的测定
对3个生产厂家提供的9批伊曲康唑原料采用以上方法测定有关物质，结果见表2。

9批样品检验结果均符合标准规定。

3.1 流动相及梯度洗脱程序的选择
EP中以27.2g/L(0.08mol/L)硫酸氢四丁基铵溶液为流动相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱测定有关物质。

本文设计采用同一色谱系统同时分析本品原料和制剂，因此分别比较了0.01、0.02、0.04和0.08mol/L不同浓度硫酸氢四丁基铵溶液对中间体和已知杂质的分离情况，最终采用0.02mol/L硫酸氢四丁基铵溶液为流动
相A，乙腈为流动相B进行梯度洗脱，并对梯度洗脱程序进行了相应调整，使伊
曲康唑峰与相邻杂质峰分离良好，各杂质之间也基本达到有效分离。

3.2 溶剂的选择
EP溶剂为甲醇-四氢呋喃(1:1)，高浓度四氢呋喃对多数常用滤膜的材质，如尼龙膜有兼容性，在制剂检测中影响有关物质的检测，因此本标准降低了溶剂中四氢呋喃的比例，将其调整为甲醇-四氢呋喃(4:1)，在供试品溶液浓度为2mg/mL时，该
溶剂可以满足样品的溶解要求。

3.3 关于系统适用性试验
在本文采用的洗脱系统中，考察了EP使用的分离度测试物质咪康唑及同类物质克霉唑、益康唑和酮康唑等，均与伊曲康唑主峰相距较远，不适于做分离度测试物质。

由图2可知，与伊曲康唑相邻的已知杂质为杂质E与杂质F，由于该两杂质不易得
到，因此采用破坏试验得到分离度试验用溶液。

四氢呋喃和甲醇挥发性强，因此不宜采用供试品溶液直接破坏。

本品在二乙胺、三乙胺等有机碱和过氧化氢溶液中溶解度均较差，在甲酸和冰醋酸等有机酸中有一定的溶解度，经试验，伊曲康唑在甲酸中溶解度更好，且经热破坏后主峰周围杂质增加，因此尝试以甲酸进行破坏。

尝试多种破坏条件后本文选定上述2.1的方法，在主峰前后获得两个降解杂质峰，多次重复试验，该两个杂质与主峰的相对保留时间基本与杂质E和杂质F一致，他们与主峰的相对保留时间分别约为0.97和1.05，可作为系统适用性试验分离度试验溶液。

但不同生产厂家的甲酸质量有所不同，甲酸质量对形成降解杂质的含量有一定影响，应注意选择并严格控制破坏条件，使该两杂质含量能达到0.1%和0.4%以上。

3.4 杂质的定量方法
试验中对EP的7个杂质的响应值做了考察，各杂质相对伊曲康唑的响应因子在0.9～1.2之间，与伊曲康唑响应值基本一致。

考虑各杂质对照品较难获得，无法实现杂质定位，故本方法未采用校正因子校正，也未对各已知杂质加以控制。

3.5 关于样品的检验结果
由样品的检验结果及杂质谱分析，各生产单位的样品质量均较稳定。

不同厂家杂质谱略有不同，厂家1的最大杂质为杂质C和D；厂家2和厂家3的最大杂质均为杂质B。

生产单位可根据样品的杂质谱更有效地控制生产工艺的稳定性，进而促进产品质量的提高。

3.6 关于色谱柱
由于本品为有机碱性化合物，且杂质个数较多，保留时间接近，对柱效要求较高，以BDS 3μm色谱柱为宜。

3.7 伊曲康唑胶囊的测定
本文方法可同时分离原料杂质、中间体和胶囊剂的杂质。

采用上述方法分析3家
生产企业的伊曲康唑胶囊，辅料均无干扰，因此本方法同时可用于伊曲康唑胶囊有关物质的测定。

【相关文献】
[1] European Directorate for the Quality of Medicines. European Pharmacopoeia[S]. (6.0).Strasbourg, 2007: 2194-2196.
[2] The British Pharmacopoeia Commission. The British Pharmacopoeia[S]. (2009). London: the Stationary Office, 2008: 1121-1123.。