eif4e和cyclin d1在肿瘤中的调控机制及临床治疗进展

DOI: 10.3969/j.issn.1673-713X.2020.02.021·
综述·eIF4E和cyclin D1在肿瘤中的调控机制
及临床治疗进展
孟沙，秦恩杰，熊敏涵，袁炜，姚运红，胡新荣
真核翻译起始因子4E（eIF4E）是在大约30% 的人类癌症中表达升高的有效致癌基因，包括结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、肺癌、头颈部癌以及白血病和淋巴瘤[1-2]。

细胞周期蛋白D1（cyclin D1）同样在乳腺癌、胰腺癌、头颈癌、结直肠癌和肺癌等中存在异常表达，且在胰腺癌、皮肤黑色素瘤、子宫内膜癌等肿瘤中，cyclin D1 影响局部浸润、转移和患者预后[3]。

两者在肿瘤的发生发展中都发挥着重要的作用，因此探讨两者之间的调控机制，并针对其调控通路开发靶向治疗药物显得意义重大。

1 eIF4E
1.1 eIF4E 的调控机制
eIF4E 作为翻译起始因子，调控细胞内靶基因的转录翻译过程，在发挥生理功能过程中形成翻译起始复合物eIF4F。

eIF4F 由3 种蛋白质组成：5' 帽结合蛋白eIF4E、脚手架蛋白质eIF4G 和RNA 解旋酶eIF4A[4]。

众所周知，真核生物mRNA（细胞质中）结构包括5' 端帽子结构（5'm7G 帽）、5' 端非翻译区（5'UTR）、翻译区（编码区）、3' 端非翻译区（3'UTR）和3' 端多聚腺苷酸尾巴。

eIF4E 能结合mRNA 的5'm7G 帽，eIF4A 发挥RNA 解旋酶的功能解开5'UTR 的二级结构，而eIF4G 则充当支架蛋白，起稳定eIF4F 复合物结构及增强eIF4A 解旋酶的作用[5]。

在胞质中，eIF4E 通过结合mRNA 的5'm7G 帽而在mRNA 转录和靶基因的翻译中发挥作用[6]。

在大多数细胞类型中，除了细胞质外，eIF4E 还存在于细胞核和整个核质中。

在核内，eIF4E 选择性转运特定mRNA，如VEGF、cyclin D1和ODC（鸟氨酸脱羧酶）到细胞质而不影响管家基因mRNA，如GAPDH 和actin 的转运或改变其转录水平[7]。

1.1.1调控eIF4E 自身活性eIF4E 主要的磷酸化位点是Ser53，但Ser209 位点的磷酸化也可提高eIF4E的活性，eIF4E 磷酸化后与mRNA 的亲和力明显增加。

研究表明eIF4E 磷酸化会诱导淋巴瘤细胞的增殖[8]。

1.1.2调控eIF4F 复合物的组装真核翻译起始因子4E 结合蛋白4E-BPs 包括4E-BP1、4E-BP2 和4E-BP3，其中4E-BP1 是4E-BPs 中最丰富的成员家庭，是eIF4F 组装的关键介质，能与eIF4G 竞争结合eIF4E，从而阻止eIF4F 复合物的形成[9]。

小泛素样修饰物蛋白-2（SUMO-2）通过增强eIF4E 和eIF4G 之间的相互作用来促进活性eIF4F 复合物的形成。

研究揭示SUMO-2 的过表达可以部分抵消4EGI-1（一种eIF4E/eIF4G 相互作用的小分子抑制剂）对eIF4F 复合物形成、帽依赖性蛋白翻译及细胞增殖和凋亡的破坏作用[10]。

1.1.3调控eIF4E 与帽结合的能力早幼粒细胞白血病蛋白（PML）是第一个被鉴定的能调节eIF4E 依赖性mRNA 输出的因子。

PML 的RING 结构域直接结合eIF4E，研究表明其能有效抑制eIF4E 输出靶mRNA、转化细胞或在血清饥饿诱导细胞凋亡实验中拯救细胞的能力[11]。

1.1.4调控eIF4E 对靶基因的核输出富含脯氨酸的同源域蛋白（PRH）结合eIF4E 破坏eIF4E 核体并抑制eIF-4E 靶标，如cyclin D1 mRNA 的mRNA 转运。

在U937 人白血病细胞中，这种调控可导致细胞增殖受到抑制[12]。

1.1.5调控eIF4E 的核回收eIF4E 主要位于细胞质中，但是在核质穿梭蛋白4E-T 的作用下，eIF4E 的大部分可以通过输入蛋白α/β 途径移动至核内，实现其在细胞内的重新分布利用[13]。

1.1.6其他研究表明，eIF4E3 在翻译（细胞质）和输出（核）功能中抑制eIF4E 的靶mRNA 库的表达，而eIF4E3 不与eIF4E 结合，表明其作用不在eIF4E 本身，并提出eIF4E3 通过竞争与eIF4E 相同的转录物库来充当肿瘤抑制因子，从而降低eIF4E 促进增殖和存活相关因子表达的能力[11]。

1.2 调控 eIF4E 的信号通路
eIF4E 的活性在多种水平上受到调节，有两种主要信号通路：大鼠肉瘤（Ras）/ 促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）/ MAPK 相互作用激酶（Mnk）和磷酸肌醇3-激酶（PI3K）/ Akt（也称为蛋白激酶B，PKB）/ 哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）。

丝裂原活化蛋白激酶相互作用激酶 1 和2（Mnk1/2）通过ser209 位点使eIF4E 磷酸化，致使促癌蛋白表达[14]。

而mTOR 直接磷酸化作为eIF4E 抑制剂的4E-BP（eIF4E 结合蛋白），使eIF4E 得以释放，与eIF4G 及eIF4A 一起形成翻译起始复合物eIF4F 促进翻译[15-16]。

基金项目：国家自然科学基金（81572566）
作者单位：523000 东莞，广东医科大学肿瘤研究所
通信作者：胡新荣，Email：404752528@
收稿日期：2019-08-27
2 cyclin D1
正常情况下，生长因子通过调控细胞周期蛋白的活化来控制细胞周期G1 期的进展。

在多种细胞中，cyclin D1 被认为是G1 期第一个被生长因子上调的细胞周期蛋白，其与细胞周期蛋白依赖性激酶4（CDK4）或CDK6 形成活性复合物，后者使成视网膜细胞瘤蛋白（Rb）磷酸化并将G1 期驱动至S 期[3, 17]。

通常Rb 在G1 期处于低磷酸化状态（即功能状态），通过与发动S 期的重要分子如转录因子E2F 等结合，抑制进入S 期所需蛋白的相关基因的转录，使细胞停滞于S 期[18]。

当cyclin D1 过表达时，会使细胞失去对生长因子的依赖，产生大量的激酶复合体，诱导Rb 磷酸化，最终释放转录因子E2F，而导致细胞增殖加速，在此过程中则易引发细胞癌变，因此cyclin D1 目前被认为与多种肿瘤的发生发展有关[19]。

3 eIF4E 与 cyclin D1 的调控关系
研究认为，在细胞核中eIF4E 关联并促进cyclin D1 的核输出，但不改变GAPDH 的mRNA。

这种区分相互作用的基础是cyclin D1 mRNA 的3'非翻译区中大约100-nt 的序列，称之为eIF4E 敏感元件（4E-SE）[20]。

eIF4E 与4E-SE 的识别依赖于LRPPPC 这一结构。

V olpon 等[21]通过下拉试验表明，eIF4E 可与LRPPPC 的N 端典型的eIF4E 结合模体相结合，而LRPPPC 通过其C 端PPR 重复序列与4ESE-RNA 结合。

另外，研究证实LRPPPC 还可直接结合CRM1 这一核输出受体，当用轻肌蛋白 B 抑制CRM1 时，会阻滞eIF4E 介导的mRNA 的核输出功能。

因此可以认为存在eIF4E-LRPPPC-4ESE-RNA-CRM1 这样一个输出作为核内mRNA 输出的基础。

未结合RNA 的LRPPPC 以及无帽的eIF4E 均可通过Importin8 实现核回收利用。

在未经治疗的白血病的病例中，Importin8 的表达升高，导致eIF4E 在核内累积。

研究表明，Importin8 通过促进eIF4E 的核回收从而促进eIF4E 依赖的mRNA 的输出功能，导致其致癌能力的提升[1]。

胞浆中eIF4E 通过与eIF4A、eIF4G 形成eIF4F 复合物而发挥其促翻译的作用，eIF4E 与mRNA 的5' 端帽子结合启动翻译。

上调eIF4E 活性可导致cyclin D1 基因的mRNA 翻译水平上调，从而促进肿瘤细胞增殖，并可导致survivin、Bcl-2 等基因的mRNA 翻译水平上调，抑制细胞凋亡并诱发放化疗抵抗和多药耐药；还可导致VEGF、FGF-2 等基因的翻译水平上调，加速肿瘤血管生成[22]。

因此，我们可以将eIF4E 对cyclin D1 的调控作用概括为两个方面：①在细胞核内eIF4E 通过与cyclin D1 mRNA3'-UTR 中的eIF4E 敏感原件4E-SE 直接结合而促进其mRNA 的核输出；②在胞质中eIF4E 通过识别cyclin D1 mRNA 中的帽子结构来促进其mRNA 的翻译。

4 针对两者调控机制的靶向治疗
由以上研究可知，eIF4E 对cyclin D1 的调节，在核内是通过eIF4E-LRPPPC-4ESE-RNA-CRM1 轴来实现的，而在核外，则需要借助eIF4F 及帽子结构来实现，那么中断或者阻滞这一轴中的任何一个环节都可成为肿瘤治疗的研究靶点。

就目前已有的研究可大致分为两类途径，即阻断核内mRNA 的输出以及阻滞胞浆mRNA 的翻译。

4.1 通过阻断 eIF4E 对 cyclin D1 mRNA 的核输出过程来靶向治疗
4.1.1染色体维持蛋白 1 的竞争性拮抗剂染色体维持蛋白1（CRM1）具有调节肿瘤抑制剂的功能，研究表明其在癌细胞中高表达，因此被认为是抗癌药物治疗的靶标[23]。

CRM1 已被确定为胃癌、卵巢癌等预后不良的标志。

作为核输出抑制的关键分子，目前已经开发了特异性CRM1 抑制剂leptomycin B、selinexor 及CRM1 抑制剂CBS9106（SL-801）等，并已进入临床试验阶段[24]。

4.1.2LRPPRC 的敲除富含亮氨酸的LRPPRC 蛋白是一种线粒体相关蛋白，属于PPR 家族，其具有较高的RNA 结合能力[25]。

研究表明LRPPRC 的表达升高与多种肿瘤的发生及预后不良有关，在前列腺癌中，其高表达预示着肿瘤更严重的进展及更短的生存期[26-27]。

Zhou 等[28]在LRPPRC 敲低实验中，能显著抑制前列腺癌细胞侵袭能力并促进凋亡。

4.2 通过阻断 eIF4E 对 cyclin D1 mRNA 的翻译过程来靶向治疗
4.2.1帽结构类似物利巴韦林是一种鸟苷类似物，其模拟mRNA m7G 帽结合位点与eIF4E 竞争性结合并降低eIF4F 复合物中磷酸化eIF4E 的翻译潜力，因此它已被用作抗癌基因药物[16]。

研究表明，eIF4E 是利巴韦林的靶标，利巴韦林可以抑制视网膜母细胞瘤细胞中的eIF4E 功能，从而抑制癌细胞生长、增殖、侵袭等。

它可降低cyclin D1、c-Myc 和VEGF 的蛋白质水平而不影响其mRNA 表达[29]。

有实验证明在顺铂耐药的鼻咽癌细胞中，利巴韦林可能通过与Ser209 位点相互作用靶向抑制eIF4E 的活性，从而抑制鼻咽癌细胞的生长[30]。

4.2.24EGI-1 4EGI-1是一类阻止eIF4E-eIF4G 相互作用的化合物，它能破坏eIF4F 复合物的形成，以此来损害eIF4E 敏感性mRNA 的翻译，除了预防eIF4G-eIF4E 相互作用外，4EGI-1 还能稳定4E-BP 与eIF4E 的结合[15]。

4.2.3其他RNA-蛋白质相互作用的RNA 免疫沉淀分析显示，PRMT5 是eIF4E 与缺氧诱导因子1α（HIF-1α）、c-Myc 和cyclin D1 mRNA 的5'-UTR 之间的相互作用所必需的。

PRMT5 敲低后可诱导细胞在G1 期的周期停滞而抑制细胞增殖。

PRMT5 通过调节对于增殖和存活至关重要的蛋白质的5'-帽依赖性翻译来把控细胞结局[31]。

4.3 直接抑制 eIF4E 的功能或表达
4.3.1eIF4E 的小干扰RNA 李亚妮等[32]用siRNA 干扰胃癌MKN28 细胞的eIF4E 后，通过Transwell 迁移和侵袭试验表明其表达下调，可抑制胃癌细胞的迁移和侵袭。

谌嫦等[33]通过实验证实eIF4E-siRNA 能够下调舌鳞癌细胞中eIF4E 的表达，并且抑制舌鳞癌细胞黏附、运动、侵袭及迁移能力。

4.3.2隐丹参酮Ge 等[34]证实隐丹参酮通过抑制真核起始因子4E 的活性能诱导多药耐药性人慢性粒细胞白血病细胞的细胞周期停滞和凋亡。

4.3.3eIF4E 特异性反义寡核苷酸（ASOs）在临床前研究中发现，eIF4E ASOs 降低了eIF4E mRNA 的表达并抑制了结直肠癌细胞的增殖，与伊立替康联合使用观察到其抗增殖效应的增加[35]。

Thumma 等[36]用eIF4E ASOs 处理NSCLC 细胞导致帽依赖性复合物形成减少，细胞增殖减少以及对吉西他滨的敏感性增加。

在分子水平上，用ASOs 抑制eIF4E 导致致癌蛋白VEGF、c-Myc 和骨桥蛋白的表达降低，单独使用eIF4E 治疗疗法或与化疗联合使用是一种有前途的方法。

4.3.4直接靶向eIF4E 的microRNA 近年来，关于microRNA 的研究愈发热烈，很多研究表明了在多种肿瘤中都有其表达下调。

有研究通过荧光素酶报告基因检测发现，microRNA-15a 可直接靶向eIF4E 的3'-UTR 中的结合位点，证明miR-15a 的过表达通过直接靶向eIF4E 再抑制细胞生长和侵袭，引起细胞周期停滞和诱导RCC 进展的细胞凋亡中发挥关键作用[37]。

Zhao 等[38]的研究结果证实miR-455-3p 通过在前列腺癌发生中直接靶向eIF4E 而起到肿瘤抑制剂的作用。

Yang 等[39]研究表明，miR-503 可通过靶向eIF4E 抑制肝细胞癌细胞（HCC）增殖并增加HCC 对治疗的敏感性。

4.3.54E-BP 磷酸化抑制剂有研究将磷酸化缺陷的截短的4E-BP2 真核表达载体导入恶性胶质瘤细胞中，发现磷酸化缺陷的截短的4E-BP2 的过表达有效抑制了eIF4E 并阻止eIF4F 复合物的形成，并抑制下游cyclin D1、Bcl-2、EGFP 等的表达，说明抑制4E-BP 的磷酸化能抑制细胞增殖和血管形成，并诱导细胞凋亡[40]。

4.4 通过阻断信号通路抑制靶向治疗
4.4.1mTOR mTOR 抑制剂是抗癌药物中较为成熟的一类，其投入临床试验已有数年。

最新的研究进展中，mTOR 抑制剂仍然被认为是肾细胞癌管理的重要推动力，其中依维莫司和乐伐替尼联合使用卡博替尼及纳武单抗被认为是转移性肾癌后续治疗的第一类选择[41]。

在卵巢癌临床研究中，发现抑制单一mTOR 通路的治疗效果依然有限，研究将雷帕霉素与FGFR 抑制剂BGJ398 联合使用后能提高抗癌效果，因此认为联合抑制成纤维细胞生长因子受体FGFR 和mTOR 通路可能是治疗卵巢癌（OC）的一种有前途的治疗策略[42]。

4.4.2Mnk1/2 抑制剂（降解剂）真核翻译起始因子4E （eIF4E）是帽依赖性翻译的主要限速部分，与肿瘤发生发展密切相关。

eIF4E 的Ser209 可被Mnk1/2 磷酸化，因此，Mnk1/2 抑制剂可降低p-eIF4E 水平并调节肿瘤相关信号通路。

有研究合成一种Mnk1/2 抑制剂吡啶酮-缩醛胺衍生物42i，并认为其针对TMD-8 细胞系具有显著效果，是治疗结肠癌的一种有前途的Mnk1/2 抑制剂[43]。

eIF4E Mnk1/2 在三阴性乳腺癌（TNBC）的发生、进展和转移中起关键作用。

研究表明，用有效的Mnk1/2 降解剂VNLG-152R 靶向Mnk-eIF4E/mTORC1 信号传导是一种新的治疗策略，可用于治疗原发性/转移性TNBC 患者[44]。

5 展望
eIF4E、cyclin D1 两者在多种肿瘤的发生发展中都占有重要地位，两者的表达升高，会造成肿瘤的恶性增殖、侵袭和转移，并影响肿瘤病人的临床预后。

在已有的研究中，大量数据显示，两者在肿瘤的发生发展上存在协同表达。

基于eIF4E 在mRNA 水平和翻译水平对cyclin D1 蛋白的调控，在肿瘤的治疗上，即可针对其调控通路开发抗癌药物。

目前研究开发药物中，雷帕霉素是相对比较成熟的一种，并且临床试验也取得了成功，但在mRNA 水平的药物开发比较欠缺，比如在核内eIF4E-LRPPPC-4ESE-RNA-CRM1 这一输出轴上，还可发现更多的治疗靶点。

目前在CRM1 的竞争性拮抗剂、LRPPPC 的敲除上已经有相关研究在进行，但均处于实验室或临床试验阶段。

4ESE 这个特殊识别序列目前研究较少，若已知其碱基序列，通过合成相应的siRNA，可能会诱导eIF4E 核输出功能的降低，从而抑制肿瘤的生长，将会是一个新的切入点。

目前，研究相对热门的microRNA 也被发现其用于肿瘤治疗方面的潜力，也将为肿瘤药物开发提供更多可能的靶点。

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Methods The neuroblastoma cells SK-N-SH were cultured in vitro to establish a H/R injury cell model. There were 8 experimental groups as following; Con group, H/R group, H/R + miR-NC group, H/R + miR-495-3p group, H/R + si-NC group, H/R + si-HDAC9 group, H/R + miR-495-3p + pcDNA group, H/R + miR-495-3p + pcDNA-HDAC9 group. Real-time quantitative polymerase chain reaction (qRT-PCR) and Western blot were used to detect the expression of miR-495-3p and histone deacetylase 9 (HDAC9), respectively. Apoptosis was detected by Annexin V-FITC/PI double staining. The levels of inflammatory factors TNF-α, IL-1β and IL-6 were detected by ELISA. Dual luciferase reporter assay was used to verify the targeting relationship of miR-495-3p to HDAC9. Western blot was used to detect the expression levels of Bax and Bcl-2 proteins.
Results As compared with the Con group, the expression level of miR-495-3p was significantly decreased in the H/R group (P < 0.05) and the expression level of HDAC9 was significantly increased (P < 0.05). The apoptosis rate (P < 0.05), the expression of Bax protein (P < 0.05), and the levels of TNF-α, IL-1β and IL-6 (P < 0.05) were increased after H/R treatment, but the expression level of Bcl-2 protein was decreased (P < 0.05). The apoptosis rate (P < 0.05), Bax protein expression level (P < 0.05) and TNF-α, IL-1β, IL-6 levels (P < 0.05) were decreased after over-expression of miR-495-3p or the inhibition of HDAC9 expression, while Bcl-2 protein expression level was increased (P < 0.05). miR-495-3p bound to the 3'UTR region of HDAC9 and down-regulated HDAC9 expression. Overexpression of HDAC9 reversed the inhibitory effect of miR-495-3p overexpression on H/R-induced apoptosis and inflammatory factor expression levels of neurons.
Conclusion miR-495-3p can protect neurons by inhibiting H/R-induced apoptosis and the production of inflammatory factors through down-regulating HDAC9 expression.
【Key words】miR-495-3p; HDAC9; Hypoxia/reoxygenation; Nerve cells; Apoptosis; Inflammation
Author Affiliations: Department of Neurosurgery, Luoyang Central Hospital Affiliated to Zhengzhou University, Luoyang 471009, China (GUO Yan-bing, YAO Qing-he); Department of Neurosurgery, The Fifth Affiliated Hospital of Zhengzhou University, Zhengzhou 470000, China (WANG Xin-jun)
Corresponding Author: WANG Xin-jun, Email: wangxj@
Chin Med Biotechnol, 2020, 15(2):190-198 （上接第219 页）
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