烟草淀粉酶活性与多酚氧化酶活性测定实验方案

烟草中淀粉酶活性与多酚氧化酶活性的测定
淀粉酶活性的测定
原理：根据淀粉酶水解淀粉产生的一系列还原性糖类可将3，5-二硝基水杨酸还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸，通过溶液颜色的深浅可反映出还原
性糖类的浓度，也就可以间接反映出淀粉酶的活性，因此，可以用比色法，通过标准曲线测定淀粉酶的活性。

实验材料，仪器，试剂
（1）.材料：烟草新鲜叶片组织
（2）.仪器：a.分光光度计 b.离心机 c.恒温水浴锅 d.具塞刻度管 e.容量瓶（3）.试剂：a.标准麦芽糖溶液（1mg/ml）；精确称取100mg麦芽糖，用蒸馏水溶解，定容至100ml。

b.3，5-二硝基水杨酸（10mg/ml）；精确称取1g3，5-二硝基水杨
酸，溶于20ml12mol/L的HONa溶液中，加入50ml蒸馏水，再加30g酒石
酸钾钠，待其溶解后用蒸馏水定容至100ml。

c.1﹪氯化钠溶液，称取5g氯化钠于500ml容量瓶中定容。

d．1﹪淀粉溶液；称取1g淀粉溶于100ml0.1ml/L的柠檬酸钠溶液中。

实验步骤
（1）.仪器药品的准备与配置；按实验需求，将所有实验中用到的器材（大型实验设备应进行检查，做好使用前准备工作）试剂准备好
a.器材包括称量用到的分析天平以及电子天平，溶解用到的容量瓶（100ml×；1000ml×2），烧杯(包括100ml×5和500ml×1)，玻璃棒，量筒等，以及实验用的数支具塞刻度试管，将上述仪器洗净并用蒸馏水浣洗，同时检查分光光度计，离心机，恒温水浴锅等设备
b．按照要求将所需求的试剂按步骤配制好，贴好标签，待用
c．冷冻样品提前做好解冻工作
（2）．标准曲线的制作；取10支具塞刻度试管，分别编号，以1号为空白对照分别按下表加入相应试剂
之后取出用流水冷却，以1号试管为空白调零点，在540nm波长下比色测定2～10号试管的OD540值，以麦芽糖含量（浓度）为横坐标，各浓度下的OD值为纵坐标，用坐标纸绘制标准曲线，求出回归方程。

（3）．酶溶液的提取；将样品分别编号，按以下步骤分别操作
a．称取2g样品于研钵中，加入少许石英砂和2ml氯化钠溶液，研磨成匀浆；
b.将匀浆转入离心管中，并用6ml氯化钠溶液分次洗涤研钵，将残渣一并洗入离心管内，于室温下放置15～20min，没隔数分钟搅动一次，使其充分提取c．然后待全部样品按上述步骤完成后，一次性转入离心机内，以3000r/min的转速离心10min，将上清液到入100ml容量瓶中，定容，摇匀，贴上相对应于样品的编号，即为淀粉酶原液，依据实际情况做好保存工作，防止酶活性退化或酶失活
（4）．样品淀粉酶活力的测定；对于每个样品进行一下操作
分别对每个样品按上述（4）步骤进行检测，记录相关数据并计算结果，将数据汇总后做成表格，
其中样品淀粉酶活力=△C×V T/(W×V s×T)(mg/g/min)。

式中，△C为从标准曲线上查得的麦芽糖含量（mg）；VT为淀粉酶原液总体积（ml）；Vs为反应所用淀粉酶原液体积（ml）；W为样品重量（g）；t为反应时间（min）。

对实验结果做出相应的分析和评价。

样品编号
OD值
A=520.00 nm
还原糖含量
(mg/ml)
酶活力
(mg/g/min)
WB-08 0.142 0.742 2.373
WB-11 0.170 0.919 2.941
WB-15 0.146 0.767 2.454
WB-19 0.243 1.381 4.420
WB-12 0.144 0.754 2.414
WB-18 0.214 1.198 3.832
WB-09 0.119 0.596 1.907
WB-13(1) 0.280 1.616 5.170
WB-16 0.155 0.824 2.637
WB-17 0.147 0.773 2.474
WB-13(2) 0.202 1.122 3.589
WB-20 0.257 1.470 4.704
WB-21 0.292 1.692 5.413
WB-10 0.154 0.818 2.616
烟草中多酚氧化酶活性的测定
原理：多酚氧化酶在有氧条件下会将酚氧化为醌，醌在525nm波长下有较强的吸光值，通过测定525mn下的吸光值变化可测得多酚氧化酶
材料，仪器，试剂
（1）材料：烟草叶片组织
（2）仪器：分光光度计离心机匀浆机试管吸量管
（3）试剂： a. 0.05mol/L PH=5.5的磷酸缓冲溶液
b. 0.1mol/L的儿茶酚溶液
c. 质量分数为20﹪的三氯乙酸
d. 不溶性聚乙烯吡咯烷酮（PVP）
e. 质量分数为30﹪的硫酸铵
f.0.1mol/L ph=6.5的磷酸缓冲溶液
g.0.01 mol/L ph=6.5的磷酸缓冲溶液
实验步骤
（1）实验设备和用品的准备；备齐实验所需器皿，洗净并用蒸馏水浣洗，检查所用设备，做好使用准备工作，备齐实验所用试剂，按要求放置妥当。

（2）酶液的提取；将所有实验材料进行分组编号，每组样品取2g，置于大研钵中，用 5ml磷酸缓冲溶液，研磨均匀，并用5ml缓冲液洗涤研钵，转入15ml离心管，4000r/min离心5min,取上清液加5ml质量分数为30﹪的硫酸铵，以4000r/min的速度离心15min，去沉淀，上清液转入40ml离心管再加质量分数为30﹪的硫酸铵10ml， 4000r/min离心15min，收集沉淀，将所得沉淀溶于1ml0.01mol/Lph=6.5的磷酸缓冲溶液中，粗制成酶溶液，将所制酶溶液放于4℃冰箱中保存，直至所有样品酶制剂都做完成。

（3）酶活性的测定；对于每一组酶制剂，分别做以下操作
将两支试管迅速放入冰水浴中，立即加入2ml的20﹪三氯乙酸，以5000r/min 的转速离心10min，收集上清液，并适当稀释，于525nm波长下测定其吸光值。

按上述步骤测定每一组样品，记录OD值
（4）酶活性的计算；以每分钟内OD525值变化0.01为一个酶活力单位计算，有下列公式
酶活性=△A·D/(0.01T)
酶的比活力=△A·D/(0.01T·W)
式中：A——反应时间内吸光值的变化；
W——样品鲜重（g）；
T——反应时间（min）；
D——稀释倍数，即提取的酶的总酶液为反应系统内酶液体积的倍数。

计算每一组样品的最终测定结果，和实验数据一起做成表格，对实验结果作出分析评价。