免疫组化染色操作步骤
免疫组化基本步骤
细胞免疫组化染色步骤1．细胞爬片，取出后，PBS洗三遍，每次3分钟。
4℃冷丙酮固定10分钟，（或用4%多聚甲醛固定30分钟），干燥30分钟。
2. 用PBS洗三次，每次5分钟，加3%过氧化氢30μl，室温孵育10分钟，（以消除内源性过氧化物酶的活性）蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
3．加1%的Triton X-100 30μl，室温孵育10分钟，增加细胞膜的通透性。
蒸馏水冲洗，PBS洗三次，每次5分钟。
4．滴加正常山羊血清30μl，封闭非特异性结合位点，以消除非特异性染色，室温孵育30分钟，倾去勿洗。
5．滴加适当稀释度的一抗，空白对照组以PBS代替一抗，4℃湿盒孵育过夜。
PBS洗三次，每次5分钟。
6．滴加生物素标记的二抗工作液30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
7．滴加辣根酶标记链酶卵白素30μl，室温孵育30分钟。
PBS洗三次，每次5分钟。
8．滴加DAB显色剂30μl，显微镜下观察显色，自来水冲洗。
9. 将处理好的玻片细胞核衬染：浸入苏木精染液染色2min，自来水洗，迅速过盐酸酒精溶液，自来水洗，过氨水溶液，自来水洗。
10.梯度酒精脱水，过70%酒精1次，95%酒精2次，无水乙醇3次，每次1min11.二甲苯透明，过二甲苯溶液3次，每次１min。
12.中性树胶封片将有细胞的一面向下，用中性树脂封片。
稀盐酸酒精溶液：用75%酒精配制1%盐酸。
淡氨水溶液：在400ml自来水中滴2滴浓氨水(使细胞核蓝化)另外：需1%TritonX-100增加细胞膜通透性。
苏木素复染时间和盐酸酒精脱色时间需自己摸索，我是染5-6秒脱色1-2秒。
盐酸酒精还可用70%乙醇配制1%盐酸。
我没用淡氨水溶液。
若为悬浮细胞则需涂片，20µl即可。
免疫组化染色(石蜡切片)操作步骤及结果分析方法(精髓版)
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
（14）苏木素染细胞核：苏木素染液5-10min（根据苏木素染液使用时间的长短，来调整染色时间）→ 流水清洗1min→ 1%盐酸酒精分化瞬时→ 流水清洗1 min→1%氨水反蓝瞬时→流水清洗1min。
常用免疫组织化学染色方法-步骤
常用免疫组织化学染色方法( 一)、ABC法：(注，下面各种方法，均为手工操作，如没特别说明，均在室温下进行)1.切片经二甲苯Ⅰ5分钟。
2.切片经二甲苯Ⅱ5分钟。
3.无水酒精Ⅰ30秒。
4.无水酒精Ⅱ30秒。
5.95%酒精Ⅰ30秒。
6.95%酒精Ⅱ30秒。
7.90%酒精30秒。
8.80%酒精30秒。
9.70%酒精30秒。
10.自来水洗。
(后面的切片脱蜡至水一般都是1-10)11.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
12.水洗。
13.抗原修复。
14.PBS洗3次，1分钟/次。
15.加入血清孵育20分钟。
16.摔干血清，加入一抗60分钟。
17.PBS洗3次，2分钟/次。
18加入二抗孵育30分钟。
19.PBS洗3次，2分钟/次。
20.加入ABC复合物，孵育30分钟。
21.PBS洗3次，2分钟/次。
22.DAB-H2O2孵育切片5-10分钟。
23.PBS洗，水洗。
24.Harris苏木素染核5-10分钟。
25.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(二)、LSAB法。
(SP法)(Labelled streptavidim biotln)1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇处理切片10-20分钟。
3.水洗。
4.抗原修复。
5.PBS洗3次，1分钟/次。
6.加入血清孵育10分钟。
7.摔去血清，加入一抗孵育30-60分钟。
8.PBS洗3次，每次2分钟。
加入二抗，孵育20分钟。
9.PBS洗3次，每次2分钟。
10.加入SP复合物孵育20-30分钟。
11.PBS洗3次，每次2分钟。
12.DAB-H2O2孵育5-10分钟。
13.PBS洗，水洗。
14.Harris苏木素染核5-10分钟。
15.水洗，分化，蓝化，脱水，透明并封固。
(三)真空负压LSAB法1.切片脱蜡至水。
2.0.3%H2O2甲醇真空负压处理5min.3.水洗。
4.如果需要，可进行抗原修复。
5.PBS洗3次，每次1分钟。
6.加入正常血清真空负压处理5min。
免 疫 组 化 染 色 步 骤
免疫组化染色步骤1.石蜡切片脱蜡和水化。
二甲苯I（10min），二甲苯II（10min），二甲苯&酒精1:1（10min），100%酒精（5min），95%酒精（5min），75%酒精（5min），50%酒精（5min），用PBS洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2.抗原修复（微波炉P-100 4-5min煮沸，P-40 维持15min，每隔4-5 min加一次柠檬酸缓冲液，不能烧干片）。
静置缓慢冷却至室温，组化笔画圈将组织圈起来（离组织边缘1-2mm），用PBS洗三次，每次3分钟（3x3`）。
3.封闭内源性过氧化物酶。
每张切片加适量的3%H2O2（将组织块儿覆盖即可），室温孵育15min（湿盒内，防干片），阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3x3`。
4.封闭。
每张切片加适量的5% 血清或者脱脂牛奶（PBS配，组织块儿覆盖即可），孵育15分钟（湿盒内），以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS洗3x3`。
5.除去封闭液，每张切片加适量一抗，室温下孵育60分钟或4℃过夜。
6.PBS冲洗3x5`。
除去PBS液，每张切片加1滴或50μl放大剂(试剂A)，室温孵育10-15分钟。
PBS冲洗3x3`。
7.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl多聚酶结合物（试剂B），室温孵育10-15分钟。
PBS冲洗3x3`。
8.除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB 或AEC使用说明书），显微镜下观察5-15分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
9.自来水冲洗，苏木素复染（20-30s），自来水冲洗，PBS返蓝。
10.如果用DAB显色，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂（详见迈新产品AEC-0038）封片。
可能出现的问题及解决办法:1. 脱蜡不彻底，容易出现非特异性背景染色，建议免疫组化切片脱蜡与常规HE脱蜡分开。
免疫组化染色操作步骤
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学,是根据抗原—抗体特异性结合的原理,应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法:直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分;间接法则先后加入一抗和二抗,形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的,该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶(PＡP)法、亲和素—生物素—过氧化物酶(ＡBC)法和链霉亲和素—过氧化物酶(ＳP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响,但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAＰ复合物（含３个酶分子和2个抗体分子),染色时依次加入一抗、二抗、ＰＡＰ复合物孵育标本,最后用H２Ｏ２和二氨基联苯（DAB)为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合４分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似,一抗不标记,二抗用生物素标记,染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上,最后加入DAＢ进行显色。
AＢＣ法的敏感性较ＰAＰ法更高。
图１. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）SP法与ABC法相似，其不同于ＡBＣ法之处在于用生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上,最后加入ＤAＢ进行显色。
与亲和素相比,链酶亲和素的结合力与亲和素相似而非特异性结合较亲和素低。
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）
免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法（精髓版）免疫组化染色（石蜡切片）操作步骤及结果分析方法一、原理及应用免疫组化，简单说是用标记的抗体对组织中相应抗原进行定位、定性和部分定量的分析。
二、操作步骤：（1）将石蜡组织切片置于65°C恒温箱，烤片1h左右。
（2）脱蜡：二甲苯I 10min→二甲苯II 10min →梯度酒精（由高到低）各5min。
（3）1×PBS 洗涤3次，每次 5min。
（4）0.5% Triton X-100通透（PBS配制），目的是使抗体能够充分地进入胞内进行结合反应。
Triton X-100 可以溶解细胞膜、细胞核膜、细胞器膜上的脂质而使抗体及大分子结构的物质进入胞浆和胞核内，这样抗体就能顺利进入胞内与相应抗原结合。
当然了，如果检测的是膜抗原无需通透，忽略该步骤。
（4）抗原修复：使用柠檬酸盐缓冲液进行抗原修复，微波炉微波高火 3min，之后转成低火 15-30min。
注：福尔马林或多聚甲醛固定，会导致蛋白交联，而解交联的过程称为抗原修复。
所以冰冻切片不需要抗原修复！！抗原修复方法有多种，一般包括两大类：酶抗原修复(胰蛋白酶、胃蛋白酶、蛋白酶K) 热抗原修复(高压蒸汽法、微波法、水浴加热法)。
微波法最为常用。
（5）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（6）3% H2O2，室温孵育30min，目的是灭活内源性过氧化物酶。
（7）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（8）使用1% BSA 进行室温封闭30min，用于封闭非特异性抗原表位。
（9）根据抗体说明书使用合适浓度的特异性一抗，4°C 湿盒中静置过夜孵育。
（10）次日取出切片，室温下复温30min。
（11）1×PBS 洗涤3次，每次5min。
（12）按照免疫组化二抗试剂盒说明书操作。
（13）DAB 显色：DAB 显色液按说明书配制，使用时滴加到血管组织上，显微镜下观察并计时，待目的蛋白显色呈棕黄色时结束显色。
冰冻切片的免疫组化染色步骤
冰冻切片的免疫组化染色步骤
1.准备工作：
（1）准备正常组织冰冻切片，使用离心切片机将原有组织材料切成
5-10μm厚的片层，切片后立即放入凝胶剂（如冰冻液中的季铵盐）内，
紧急冷冻到-20℃；
（2）准备石蜡糊，将石蜡熔解并加入一定量的溶剂使其至流体状态；
（3）准备免疫染色的药品，比如羊抗体、抗原标记物（Biotinimidazole）、Streptavidin-HRP（HorseradishPeroxidase）等。
（1）将冰冻切片浸入石蜡糊中进行热融化处理，处理完毕后将其放
置于待用；
（2）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用70％乙醇清洗，然后放
入PBS小规模洗涤，然后用清洗液（清水）浇上，以去除表面的乙醇；
（3）将冰冻切片浸泡在去除组织胶多聚体液中，液体里溶解蛋白质
类多聚体，以防止抗体与冰冻切片上的组织胶多聚体结合；
（4）将冰冻切片放置在明净的工作台上，用于抗体的定量涂布，将
抗体与切片表面的抗原结合；
（5）在抗体涂布完毕后，将冰冻切片置于含有PBS溶液的室温下供
2小时以上，使抗体能够与冰冻切片上的抗原结合；
（6）将冰冻切片从室温溶液中取出，放入冰冻液中，将表面的多余
抗体冲洗掉；。
免疫组化操作规程及操作流程
免疫组化操作规程及操作流程免疫组化技术是一种常用的细胞和组织学研究方法，广泛应用于病理学、生物学、药理学等领域。
下面将详细介绍免疫组化操作规程及操作流程。
一、实验前准备1.准备实验所需的试剂和试验设备，包括抗体、缓冲液、加标物、显色剂等。
2.检查免疫组化试剂的有效期，确保试剂的质量。
二、标本处理1.收集组织标本，如活检样本或动物组织。
2.快速处理标本，迅速取出，并选择适当的处理方法，如固定、包埋等。
3.处理过程中要避免标本的冻融、干燥等。
三、抗原回复1.对于经过固定的组织标本，使用抗原回复方法来恢复组织标本中的抗原活性。
2.选择适当的抗原回复方法，如热处理、酶解等。
四、非特异性结合阻断1.使用非特异性抗血清或蛋白质来阻断非特异性结合位点。
2.使非特异结合抗体活性降低，减少假阳性结果。
五、抗体处理2.优化抗体浓度，确保抗体与标本中的抗原结合。
3.对于特定抗体，可以进行荧光标记或酶标记等。
六、免疫组织染色1.用适当的缓冲液稀释抗体，并将其应用于组织标本上。
2.根据实验需求选择适当的孵育时间和温度。
3.利用显色剂或荧光显像剂对标本进行染色。
七、显微镜观察与分析1.将染色后的标本放置在显微镜下观察，并选择适当的增强荧光信号方法。
2.结合相关的正对照和负对照进行结果分析，确定一些蛋白质在组织中的表达情况。
3.分析结果并记录数据。
八、结果分析与报告1.根据观察结果，分析样本中目标抗原的表达情况。
2.比较不同样本之间的差异，得出结论并撰写实验报告。
九、实验后处理1.清洗使用过的实验工具和材料，避免交叉污染。
2.妥善处理废弃物和化学品，根据实验室内相应的安全操作规范进行处理。
蛋白实验技术——免疫组化实验步骤
蛋白实验技术——免疫组化实验步骤（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉。
2. 水浴锅。
（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB，ph6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226；2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml。
4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris 碱，用1N的HCl调至ph8.0，加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。
b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
7.风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS（PBS）配制。
8．TBS/PBS PH9.0–9.5，适用于荧光纤维镜标本；ph7.0-7.4适合光学纤维标本。
（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复：在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。
将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤
1.准备染色：将需要染色的组织切片用4%-10％的甲醛溶液处理，然后放入0.2%的甲醛溶液中浸泡10-15分钟，除去水分后，用石蜡或玻璃滑片冰冻干燥后备用；
2.细胞选择：将滑片放在温度为60℃的预处理室内，经过5分钟的预处理，清除细胞的表面活性物质；
3.免疫化学染色：选择适宜的免疫染色培养液，将其放入干燥的滑片上，放入正常培养的锅炉内，温度在37℃；持续室温处理60min，以停止免疫反应；
4.洗涤：将染色滑片放入PBS洗涤3次，每次洗涤10min，使抗体与反应物完全稳定，以避免多余的洗涤对结果的干扰；
5.染色：将抗体连接到细胞上，使用应用适当的洗涤液将染色滑片淋洗；然后使用适当的染料进行染色，建议使用DAPI染色，因为其能够在高度细胞存在下染色，或者使用其他染色方法，比如无铁紫藤染色，铜绿假单胞菌染色等；
6.滤过：将染色滑片分批放在滤纸上，进行滤过，以减少染料在细胞上积累的可能性；
7.拍摄：使用荧光显微镜拍摄染色细胞，绘制免疫组化染色的结果图片，为最终研究结果的分析提供数据支持。
免疫组化染色
免疫组化染色一．石蜡切片免疫组化染色实验步骤：1．石蜡切片脱蜡至水：（石蜡切片染色前应置60℃1小时）。
（1）二甲苯I、II,各10分钟。
（2）梯度酒精：100%，2分钟→ 95%，2分钟→ 80%，2分钟→ 70%2分钟。
（3）蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
2．过氧化氢封闭内源性过氧化物酶：3%H2O2，室温10分钟（避光）。
3．蒸馏水洗：5分钟，2次（置于摇床）。
4．抗原修复：根据待检测的抗原，选择适当的方法。
附：抗原修复液（10mM pH 6.0枸橼酸钠缓冲液）的配制（1）储备液的配制：A液：枸橼酸三钠-2H2O 29.41g + 蒸馏水1000mlB液：枸橼酸21g + 蒸馏水1000ml（2）工作液的配制：A液82ml + B液18ml + 蒸馏水900ml抗原修复的方法：（1）高压锅处理技术：枸橼酸钠缓冲液（10mM，PH6.0）,淹没切片,盖上锅盖，高压锅内煮沸,上汽3分钟后缓慢冷却（可用自来水在高压锅外冲，以助冷却）。
（2）微波处理技术:用塑料切片架,置于塑料或耐温玻璃容器内，枸橼酸钠缓冲液淹没切片，选择中高或高档,5分钟;取出并补充已预热的枸橼酸钠缓冲液；再选择中高或高档,5分钟.（最佳温度为92~95℃）（3）酶消化处理：此略。
抗原修复的注意事项：（1）组织不能干。
（2）选择抗原修复方法要因抗体而异。
（3）该方法主要用于10%福尔马林固定、石蜡包埋组织。
（4）抗原修复后至DAB显色的过程中，均需用PBS缓冲液。
5．PBS：5分钟，2次（置于摇床）。
6．正常血清封闭：从染片缸中取出切片，擦净切片背面水分及切片正面组织周围的水分（保持组织呈湿润状态）,滴加正常山羊或兔血清（与第二抗体同源动物血清）处理，37℃，15分钟。
附：正常血清配制(或按试剂盒规定的浓度配制)按1:20比例,用PBS配制,每张切片需要量按50μl+5μl (10%抛洒量)计算。
7．滴加第一抗体：用滤纸吸去血清，不洗，直接滴加第一抗体，37℃2小时（也可置于4℃冰箱过夜）。
免疫组化染色操作步骤
免疫组化染色操作步骤免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种在组织学上，通过对细胞和组织中一些免疫反应物的特异性染色来研究蛋白质表达和分布的方法。
免疫组化染色操作步骤一般包括以下几个主要步骤：组织固定、切片、抗原修复、抗原阻断、一抗和二抗染色、显色反应和染色质反应控制。
下面将详细介绍每个步骤。
一、组织固定组织固定是将新鲜组织固定在组织学玻片上以保持其形态和结构。
常用的固定剂有甲醛和乙酸（酒精）。
固定剂的选择应根据研究目的和检测的抗原选择合适的固定剂。
甲醛固定对细胞膜蛋白质有较好的保护作用，适用于一些膜蛋白的免疫染色；而乙酸（酒精）固定可以在较短时间内固定组织，适用于快速染色的情况。
二、切片固定好的组织需要进行切片处理，将其切割成5-10微米厚的切片。
常用的器械有冰冻刀、滑刀等。
冰冻刀用于切割冰冻组织，滑刀用于切割固定组织。
切割好的组织切片需要进行干燥处理。
三、抗原修复抗原修复是为了恢复组织中被固定剂破坏的抗原形态。
抗原修复的方法一般有热诱导抗原修复和酶诱导抗原修复两种。
热诱导抗原修复是将切片浸泡在高温的缓冲液中进行加热处理，常用的缓冲液有PBS、Tris等。
酶诱导抗原修复是通过加入蛋白酶K等酶来修复抗原。
四、抗原阻断抗原阻断是为了阻止非特异性的结合，减少假阳性结果。
一般是通过加入牛血清白蛋白（BSA）或小鼠IgG等蛋白质来阻断非特异性结合位点。
五、一抗和二抗染色一抗是指充分体内或体外免疫后所制备的单克隆或多克隆抗体。
在进行一抗染色前，需要对切片进行预处理，如使用过氧化氢或金胶子等对内源性酶进行体外灭活。
一抗的稀释倍数需要根据标示规定，也可以进行实验室优化。
一般在4℃下孵育过夜。
第二天，用PBS进行洗涤后加入二抗。
二抗是对一抗的特异性抗体，通常是兔抗小鼠或小鼠抗兔的抗体。
加入二抗后，需要进行适当时间的孵育，一般是30分钟到1小时，然后用PBS进行洗涤。
六、显色反应显色反应是为了检测所免疫染色的反应物。
免疫组化HE染色步骤
骨组织石蜡切片制作步骤：1.固定：切取骨缺损出的骨组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛缓冲液内固定12—24h。
2.脱钙：将固定好的骨组织放入脱钙液中侵泡脱钙24h.3.脱水：将固定好的骨组织用蒸馏水冲洗3次，再用50%的酒精冲洗2次，常规脱水，70%酒精（60min），80%酒精（40min）,95%酒精（30min）,100%酒精1（25min）,100%酒精II（25min）。
4.透明：二甲苯I(35min)，二甲苯II（35min）。
5.包埋：将透明处理后的骨组织依次侵入石蜡I1小时，石蜡II1小时。
6.切片：包埋后的组织块经修理后，用切片机切成4um的石蜡带，将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用干净的载玻片捞片。
7.烤片：将切好的组织片放入63℃恒温箱中烤片2小时。
免疫组化检测步骤：1.脱蜡：将组织切片放入62℃恒温箱中烘烤20min二甲苯1（10min）二甲苯2（10min）。
2.水化：100%酒精1（2min）100%酒精（2min）95%酒精（2min）80%酒精（2min）70%酒精(2min)。
3.PBS冲洗3次，每次5min.。
4.抗原修复：将组织片置0.01M的柠檬酸缓冲液（PH6.0）中煮沸15min,自然冷却至室温。
5.PBS冲洗3次，每次5min。
6.阻断：3%去离子水37℃孵育10min,以灭活内源性过氧化物酶活性。
7.PBS冲洗3次，每次5min。
8.滴加1抗（GFP1：100稀释,4℃过夜）9.PBS冲洗3次，每次5min。
10.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂1，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。
11.滴加二步法免疫组化检测试剂的试剂2，37℃孵育,20min,PBS冲洗3次，每次5min。
12.DAB显色5min。
13.自来水冲洗10min。
14.苏木精复染2min,盐酸酒精分化。
15.自来水冲洗10min。
16.常规脱水，透明，封片，镜检。
免疫组化步骤
免疫组化染色步骤1、常规脱蜡至水二甲苯I 20min；二甲苯II 20min；100%乙醇5min；95%乙醇5min; 80%乙醇5min；70%乙醇5min; 蒸馏水5min。
2、消除内源性过氧化物酶3%H202处理30min，蒸馏水冲洗5min×2次。
（3%H202配制：30ml的30%的双氧水溶于300ml蒸馏水，搅拌均匀）3、微波修复将切片置于0.01mol/L枸橼酸钠缓冲液中，微波修复至刚刚沸腾，隔5分钟后再一次加热至即将沸腾，重复2-3次，取出后自然冷却。
PBS冲洗5min×3次。
此步骤很关键，修复时要时刻观察，一沸腾即要关闭微波炉，要不然片子上的组织很容易脱片，而且修复过久容易到时假阳性，即基本是所有的细胞都染色了颜色。
（0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液的配制：柠檬酸钠3g，柠檬酸0.4g加入1000ml蒸馏水，最终PH＝6）4、封闭非特异性抗原结合位点用5%BSA滴加到目标组织上，放入湿盒内在37度孵育20min，甩去多于液体。
（5%BSA溶液配制体系为2ML：0.1gBSA溶于2ML的PBS中）5、滴加一抗滴加一抗于目标组织上，放入湿盒内，40C冰箱过夜。
（一抗需要用PBS稀释）6、滴加二抗从40C冰箱取出湿盒，使其自然恢复至室温，PBS冲洗5min×3次，滴加二抗于组织上，37度25min，PBS冲洗5min×3次。
7、滴加SABC滴加SABC于组织上，370C放置25min，PBS冲洗5min×3次。
8、显色将试剂盒中的ABC三种试剂按顺序依次滴加一滴于1ml蒸馏水中，混匀，滴加到目标组织上。
通过观测组织颜色的变化情况来确定显色时间。
根据显微镜下的观察决定终止显色的时间一般都在3-10min左右，最常用5min。
自来水冲洗：自来水充分冲洗10-15min,注意：冲洗的时候要注意水流不要太大，缓慢的冲洗。
9、复染苏木素复染5至10 S，自来水冲洗数分钟（在自来水中晃动），若染色过蓝，可以放入0.5%盐酸酒精中分化数秒（摆两下就好），再在自来水中晃动。
免疫组化操作步骤自编
免疫组化操作步骤一免疫组化（LP法）操作步骤：1.切片常规脱蜡至水。
如需抗原修复，可在此步后进行2.缓冲液洗3min/2次。
3.为了降低内源性过氧化物酶造成的非特异性背景染色，将切片放在Hydrogen Peroxide Block 中孵育10-15 分钟。
4.缓冲液洗5min/2次。
5.滴加Ultra V Block ,在室温下孵育5分钟以封闭非特异性的背景染色。
（注：孵育不要超过10分钟，否则会导致特异性染色降低。
如果一抗的稀释液中含有5 一10%正常羊血活，这一步可以省略。
）6.缓冲液洗5min/2次。
7.滴加一抗工作液37 C孵育1 — 2小时。
（具体孵育时间和温度由试验者最终决定）8.缓冲液洗5min/2次。
9. 滴加Primary Antibody Enhancer（增强子），在室温下孵育20分钟。
10.缓冲液洗5min/2 次。
11.滴加HRP Polymer（酶标二抗），在室温下孵育30分钟。
（注：HRP Polymer对光敏感，应避免不必要的光暴露并储存在不透明的小瓶中。
）12.缓冲液洗5min/2 次。
13.向1ml DABPlus Substrate （或 AEC Plus Substrate）中滴加1-2 滴DAB Plus Chromogen （或AEC Plus Chromogen ）,混匀后滴加到切片上，孵育 3 — 15 分钟。
（具体时间由染色深浅决定。
）14.自来水充分冲洗，复染，脱水，透明，封片。
二.免疫组化（三步法）操作步骤：（1 ）、石蜡切片脱蜡至水。
（2 ）、3%H 2 O 2室温孵育5-10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
（3 ）、蒸僻水冲洗，PBS浸泡5分钟x2 （如需抗原修复，可在此步后进行）。
（4 ）、5-10%正常山羊血活（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟，倾去血活，勿洗。
滴加一抗工作液，37 C孵育1-2小时或4 C过夜。
（5 ）、PBS冲洗，5分钟x3次。
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免疫组化染色操作步骤 Document serial number【UU89WT-UU98YT-UU8CB-UUUT-UUT108】
免疫组织化学染色原理和操作步骤一、免疫组织化学原理
免疫组织化学（IHC）又称免疫细胞化学，是根据抗原—抗体特异性结合的原理，应用带有可见标记的特异性抗体作为探针，检测组织和细胞中抗原性物质的一种技术。
免疫组化技术主要有直接法和间接法：直接法是以标记的一抗孵育标本以检测其中的抗原成分；间接法则先后加入一抗和二抗，形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的，该法因二抗的放大作用而具有较高的敏感性。
间接法常用的有过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）法、亲和素—生物素—过氧化物酶（ABC）法和链霉亲和素—过氧化物酶（SP）法。
PAP法一抗和二抗均不标记，避免了标记过程对抗体活性的影响，但需要制备过氧化物酶的抗体，与适量过氧化物酶混合形成PAP复合物（含3个酶分子和
2个抗体分子），染色时依次加入一抗、二抗、PAP复合物孵育标本，最后用H
2O 2
和二氨基联苯（DAB）为底物显示过氧化物酶，即可检测标本中的抗原成分。
生物素为含硫的杂环单羧酸，可通过其羧基与蛋白质中的氨基结合，从而标记抗体和酶。
亲合素又称抗生物素蛋白，与生物素有很高的亲合力，1分子亲合素可结合4分子生物素，ABC法即在此基础上建立。
ABC法与PAP法相似，一抗不标记，二抗用生物素标记，染色前按一定比例将亲和素与生物素标记的过氧化物酶混合，制成ABC复合物，并使亲合素分子上至少空出一个生物素结合位点。
在标本孵育过一抗和二抗后，再加入ABC复合物使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
ABC法的敏感性较PAP法更高。
图1. 免疫组织化学基本原理示意图（引自八年制《组织学与胚胎学》）
SP法与ABC法相似，其不同于ABC法之处在于用
生物学特性与亲和素相似的链亲和素标记过氧化物酶。
在标本孵育过一抗和二抗后，加入链亲和素标记的过氧化物酶使其结合到二抗的生物素上，最后加入DAB进行显色。
与亲和素相比，链酶亲和素的结合力与亲和素相
似而非特异性结合较亲和素低。
SP法简化了操作步骤，
图2. SP法原理
同时也减少了非特异性背景，是目前应用最为广泛的免疫绥化染色技术。
二、实验准备：
1. 标本准备
①石蜡包埋组织切片：由病理室常规处理
②冰冻组织切片：由病理室常规处理
③细胞爬片：将无菌盖玻片置于六孔板中，接种细胞，待细胞生长达到60％以上后取出玻片，4%多聚甲醛固定2 h。
2.试剂准备
①抗体选择
单克隆抗体针对单一表位，具有较高的特异性，但在该表位破坏后将得不到阳性结果；多克隆抗体表位针对多个表位，可避免单克隆抗体的缺点，但是可能出现非特异性杂交。
因此，不论选择单克隆还是多克隆抗体，最好同时购买两个货号的抗体，购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体，抗体说明书上必须有IHC测试结果。
如果该分子文献报道较多，可选择文献上常用的经典抗体。
②二抗试剂盒
目前本实验室所用二抗试剂盒为Life Technologies Histostain-Plus Kit (HRP, Broad Spectrum)，货号85-9043，一抗反应性有小鼠、大鼠、兔和豚鼠。
③DAB 试剂盒
目前本实验室所用为加强型DAB 显色试剂盒，货号DAB-2032。
④其他试剂
二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠、APES 胶
3. 抗体特异性验证
所有免疫组化抗体均须Western blot 验证抗体特异性，并需免疫荧光实验验证抗原定位。
4. 耗材准备
免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片
5. 溶液配制
①磷酸盐缓冲液（PBS ）
10×PBS 母液配制
NaCl
72 g Na 2HPO 4·12H 2O g
KH 2PO 4
加蒸馏水至1000 ml ，充分混匀贮存。
使用时用蒸馏水10倍稀释，调整pH 值至—。
②柠檬酸抗原修复液
抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，配方如下：
称取柠檬酸 g ，溶于500 ml 蒸馏水；称取Na 2HPO 4·12H 2O ，溶于800 ml 蒸
馏水。
分别量取358 ml 柠檬酸溶液和642 ml Na 2HPO 4溶液，充分混匀后调整pH
值至，即得2×母液，贮存备用。
③1%盐酸酒精
浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合，充分混匀。
三、免疫组化操作步骤
1. 组织片脱蜡水化
①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡，每缸15 min 。
②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸，每缸5 min 。
③依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸，每缸5 min 。
④依次放入90％乙醇、85％乙醇、75%乙醇的玻璃缸，每缸2 min ，取出。
⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。
2. 抗原修复
将切片浸入1×柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中，高压煮沸后继续加热2 min ，然后停止加热让切片自然冷却。
注意：抗原修复过度或不足，均会影响最终染色结果。
切片骤冷可致脱片，必须自然冷却！
3. 封闭内源性过氧化氢酶
①放入3% H 2O 2溶液的玻璃缸中，浸泡15 min 。
②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗，重复3次。
③放入PBS 缓冲液的玻璃缸中，浸泡5 min 。
4. 抗体杂交
①甩去PBS余液，将组织片平辅在湿盒中，加正常山羊血清1滴20 μl（试剂盒中的A液，根据组织大小调整用量），28℃放置20 min，甩干。
②加稀释好的一抗1滴（20~50 μl，根据组织块大小进行调整），置于湿盒4℃过夜。
③置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作4次，甩干。
④加入生物素偶联的二抗20~50 μl（试剂盒中的B液，根据组织块大小进行调整），放置湿盒，37℃放置20 min。
⑤置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。
5. 显色
①加链亲和素-辣根过氧化物酶20~50 μl（试剂盒中的C液，根据组织块大小进行调整），湿盒内28℃放置5~20 min，甩干。
②置PBS缓冲液的玻璃缸中，缓慢振荡清洗5 min，更换PBS缓冲液，同法操作3次，甩干。
③滴加新鲜配制的DAB工作液100 μl（以覆盖组织为宜），放置观察反应部位呈现黄褐色时（3~5 min），置装有自来水玻璃缸中涮洗3次；
6. 复染
浸入苏木精溶液中复染，放置5 min后，用自来水反复涮洗至水不变色，再用1%盐酸酒精分化1—2 s后，自来水冲洗后，反蓝水洗2 min。
7. 脱水、透明和封片
①依次放入95％、95％乙醇溶液的玻璃缸中，每缸浸泡5 min，取出；
②依次放入2个无水乙醇的玻璃缸中，每缸浸泡5 min，取出。
③依次放入2个装有二甲苯的玻璃缸中，每缸浸泡5 min，取出。
④滴加适量中性树胶，封片，晾干。
8. 注意事项
①整个染色过程中组织块要保持湿润，不能干片，否则会导致非特异性染色。
②组织切片边缘易干，因此抗体、封闭液、显色液等试剂要充分覆盖组织块，避免干片。
四、结果判定
1. 阳性细胞判断
DAB显色呈黄色。
每批染色都要有特异性阳性和阴性对照为基础，才能对染色结果作出判断。
抗原表达必须在特定部位，对于临床诊断来说，不在抗原所在部位的阳性着色，一概不能视为阳性。
尽量避开出血、坏死及切片刀痕和界面边缘细胞的着色多系内源干扰或人为因素所致，不能视为阳性。
2.抗原表达评价
免疫显色强度和阳性细胞密度是定性定量指标，实际工作中常采用强度和密度结合的方法综合计量，我们常用的免疫组化评分方法如下：
细胞染色强度评分：0（无染色），1（弱染色），2（中染色），3（强染色）
肿瘤细胞阳性率评分：0（0~9%），1（10%~25%），2（26%~50%），3
（51%~75%），4（76%~100%）
将染色强度评分和阳性细胞率评分的乘积作为该切片评分值。