在质粒载体中进行平末端片段的克隆

在质粒载体中进行平末端片段的克隆
佚名
在质粒载体中进行平末端片段的克隆
1．分别设立两个反应，用适当的限制性内切核酸酶消化1~10μg质粒DNA和外源DNA片段，使它们能产生平末端。

2．苯酚：氯仿抽提与乙醇沉淀法纯化出已被消化的载体和外源DNA片段。

3．分别用TE（pH 8.0）重新溶解纯化出的两种DNA沉淀，使终浓度为100 ng/ml。

假设1 bp相当于660 Da，计算DNA的终浓度（pmol/ml）。

4．将载体DNA去磷酸化。

5．按下表将适量的DNA转移至无菌的0.5 ml离心管：
管号DNA
A和E 载体1 [60fmol (~100ng)]
B 外源插入片段2[60fmol (~10ng)]
C和F 载体1（60fmol）和外源插入片段3（60fmol）
D 线状载体（5’-磷酸化）（60fmol）
G 环状载体[60fmol (~10ng)]
1载体DNA已进行去磷酸化
2外源目的DNA可以连接接头。

3 连接反应中，质粒载体和插入的DNA片段摩尔比一般为1：1。

DNA的总浓度应约为10ng/μl。

a.A、B和C管中加入：
10×连接缓冲液 1.0μl
T4噬菌体连接酶 0.5 Weiss单位
5 mmol/L ATP 1.0μl
H2O 补至8.5μl
30%PEG 8000 1~1.5μl
b.D、E和F管中加入：
10×连接缓冲液 1.0μl
5 mmol/L ATP 1.0μl
H2O 补至8.5μl
30%PEG 8000 1~1.5μl
不加DNA酶
6．连接反应体系置于16℃水浴温育过夜或20℃水浴温育4 h。

7．用每份稀释的连接产物转化感受态大肠杆菌。

转化时，应包括用标准方法制备的已知量的超螺旋质粒DNA作为对照，以检查转化效率。

管号DNA 连接酶（有/无）预期转化克隆数
A 载体1+ ~03
B 插入片段+ 0
C 载体1和插入片段+ 比F管高5倍
D 载体1- ~0
E 载体2- 比D管高50倍
F 载体和插入片段- 比D管高50倍
G 环状质粒- 2×105
1去磷酸化
2未去磷酸化
3如果出现来自去磷酸化的载体DNA自身连接产物的转化子，是由于用碱性磷酸酶处理时未能除尽5’端的磷酸基。