Eca109细胞中自噬模型的建立

第37卷第6期 2016年12月
暨南大学学报（自然科学与医学版）
Journal of Jinan University (Natural Science & Medicine Edition)
Vol. 37 No. 6
Dec. 2016 Ecal09细胞中自噬模型的建立
李晓苗\刘伊宁\来旻婷1，吉别克•瓦提别克1，美昍吾尔提•达吾列提汗1，沙亚哈提•别尔克哈之\王海峰2，李颖\李惠武3，李卉4
(新疆医科大学1.基础医学院;2.附属肿瘤医院；3.附属肿瘤医院肿瘤研究所；4.中心实验室，新疆乌鲁木齐830011) [摘要]目的：在食管鳞癌细胞Ecal09中建立自噬模型.方法：按照常规细胞培养方法，将PmC heny-GFP-LC3
质粒转染进人Ecal09细胞，mcheny为红色荧光蛋白，GFP为绿色荧光蛋白，可示踪自噬体形成.加人浓度为50
mnol/L自噬激活剂雷帕霉素,建立自噬模型.采用电镜观察雷帕霉素诱导后细胞中自噬小体的产生,激光共聚焦显 微镜观察自噬发展的阶段,并对发生自唆行为的细胞进行计数.结果：雷帕霉素诱导后可见明显的自噬小体，激光 共聚焦采图可见自噬细胞数量明显增多(P < 〇. 05 ).结论:1.在Ecal09细胞中通过加人自噬诱导剂雷帕霉素成功构 建细胞自噬模型;2.细胞自唆模型的建立为研究肿瘤细胞自噬活动的现象和分子调控机制提供了新的实验平台.
[关键词]食管鳞癌；Ecal09细胞；自噬；雷帕霉素
[中图分类号]R73-3 [文献标志码] A [文章编号]1000 -9965(2016)06 -0492 -05
doi ： 10.11778/j. jdxb. 2016.06.009
Ecal09 autophagy in the cell model
LI Xiaomiao1, LIU Yining1, LAI Wenting1, Jibieke Watibieke1, Meiliwuerti Dawulietihan1, Shayahati Bieerkehazhi1, WANG Hai feng2 , LI Ying1, LI Huiwu3, LI Hui4
(1. Basic Medicine School，Xinjiang Medical University；
2. Department of Thoracic Surgery, tird Affilliated Hospital, Xinjiang Medical Univesity；
3. Cancer Prevention and Resacher Institute, the Affiliated Tumor Hospital of Xinjiang Medical University；
4. Central Laboratory of Xinjiang Medical University, Urumqi 830011, China)
[Abstract] Aim；To construct an autophagy model in esophageal squamous cancer cell line Ecal09.
Methods：According to the conventional cell culture method, the pmcherry-GFP-LC3 plasmidwas trans­
fected into Ecal09 cells. The formation process of autophagy that induced with rapamycin (rapamycin,
RAPA) can be predicted by representative fluorescent images of Ecal09 cells transiently transfected with
pmcherry-GFP-LC3. Using the methods of electron microscope to show the autophagosome in cells, and
the laser confocal microscope to present the development stages of autophagy. Results：apparently, RA­
PA could induce autophagosome formation, the count of visible autophagosomes in cells increased signifi­
cantly via laser confocal microscope (P < 0. 05 ) . Conclusion； autophagy model induced with RAPA has
been established in the Ecal09 cells, which will be important for the further studies of the molecular reg­
ulatory mechanism in the stage of autophagy-lysosome formation in tumor cells.
[Key words] esophageal squamous cell carcinomas; Ecal09 cells; autophagy; rapamycin
[收稿日期]2016 -09 -26
[基金项目]国家自然科学基金项目（Sl66〇459)
[作者简介]李晓苗（1992-)，女，研究方向：细胞自噬
通信作者:李卉，女，副研究员，研究方向:食管癌分子发病机制，E-mail: huihui922@
第6期李晓苗，等:Eca109细胞中自噬模型的建立493
细胞自噬（autophagy)是真核细胞利用溶酶体 对细胞器及蛋白质进行降解的生物学过程[1]，广泛 存在于高等脊椎动物的细胞内[2]，是维持细胞内环 境自稳的一种自我保护机制，是由溶酶体介导的降 解细胞内受损的蛋白质或者细胞器的代谢过程.M 1962年，Aashford和Porten通过电子显微镜在人的 肝细胞中观察到了自噬现象.1993年Tsukada14-5」在酵母菌中发现了自噬的相关基因，细胞自噬研究 才有了新的进展.自噬根据功能和进入溶酶体途径 可分为3种:分子伴侣介导（chaperone mediated autophagy，CMA)的自幢、巨自幢（macroautophagy )和微自噬（microautophagy).目前，人们已经发现的 细胞自噬主要调控机制包括：（1)自噬相关基因 ATG(autophagy related,ATG) ;(2)哺乳动物西罗莫 司祀蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR);
(3 )鱗酸腺音活化蛋白激酶（AMP activated protein kinase，AMPK); (4)PI3K通路酪氨酸激酶受体(tyrosine kinase receptor，RTK) ;(5) p53 通路.细胞 自噬可维持能量代谢，应对应激改变，参与细胞胞质 重建和维持细胞稳态W，可引起细胞程序性死亡，清除体内无用或病理改变的细胞过程.细胞自噬模 型是研究细胞自噬分子机制和药物作用机理的一种 重要手段.本研究通过将pmcheiry-GFP-LC3质粒转 染食管鳞癌细胞EC al09细胞，再以自噬激活剂雷帕 霉素（mpamycin，RAPA)诱导，建立自噬模型.
1材料与方法
1.1材料
E cal09细胞、DMEM高糖培养基、胎牛血清购 自四季青公司;青链霉素混合液购自Solarbio公司；OPTI-MEM购自gibco公司；电转杯购自BIO-RAD 公司；pmcheiry-GFP-LC3过表达载体购自权阳生物 公司;L B培养基、氨苄青霉素购自上海生工公司;雷 帕霉素购自Sigma公司；共聚焦培养皿购自NEST 公司.
1.2细胞培养和基因转染
将装有ECa l09细胞的冻存管从液氮罐中取出，立即套上薄膜手套放入37 T水浴锅中，直至完全融 化为液体，离心5 m in,转速1 000 r/m in.离心后弃 去上清液，冻存管中加入1 m L的DMEM高糖培养 基(含质量分数10%胎牛血清和1%青链霉素混合 液)将细胞悬浮起来，将细胞悬液移入25 cm2的细 胞培养瓶中，再向培养瓶中加入3 m L培养基，培养 瓶置于体积分数为5%的C02、37°C的培养箱内过 夜培养.每天换液，2〜3d传代1次，取对数生长期细胞进行电转染.将消化后的细胞分别用PBS，0Pti-MEM悬浮离心，制成Opti-MEM细胞悬液（细胞个 数为3 x l05/mL)，加人电转杯中，并在电转杯中加 入7 jjig的pmcheiry-GFP-LC3质粒进行转染（转染 条件:270 V，550 f l，900F).转染后置于体积分数为 5%的C02、37 °C的培养箱内培养，6h后换液，以浓 度为50 nmol/L的雷帕霉素处理细胞，于体积分数 为5%的C02、37 °C的培养箱培养24 h.
13电镜观察
取转染后24 h细胞，消化，离心.弃上清，沿管 壁徐徐加入体积分数为2.5%的戊二醛固定2 h.磷 酸缓冲液漂洗3次，每次10 min，体积分数为1%锇 酸固定，乙醇系列脱水，Epon 812环氧树脂包埋. LKB-2188型超薄切片机切片，醋酸双氧铀及柠檬酸 铅双重电子染色.JEOL1230型透射电镜观察、摄片.
1.4激光共聚焦显微镜观察
pmcheiry-GFP-LC3可同时表达红色、绿色荧光. 细胞经pmC heny-GFP-LC3转染后，取RAPA诱导的 Ecal09细胞和未经RAPA诱导的对照组细胞，在 400倍视野下进行观察，并分别计数表达红色、绿色 荧光的细胞数目，表达荧光细胞内荧光颗粒的数目，含有荧光颗粒的细胞数目进行计数.
2实验结果
2.1食管鳞癌细胞Ecal09自噬模型的建立和鉴定
自噬研究过程中，通过透射电镜可以观察到自 噬体的双层膜或单层膜结构，更直观地说明自噬的 诱导.电子透射电镜技术是检测自噬诱导的“金标 准”W•用透射电镜分别以3万倍、4万倍视野下观 察未经雷帕霉素诱导的对照组自噬小体及加人雷帕 霉素激活自噬的自噬诱导组自噬小体（图1).可见 经诱导后细胞中的自噬小体数量明显增多.
左，x30000 翁，x40000
图1对照组自噬体，自噬诱导组自噬体
Fig. 1 Electron microscopy image of Ecal09 cells Autophago­some of Ecal09 cells in control group (left, X 30000).
Autophagosome of Eca 109 cells in rapamycin induced
group (left,
x 40000 )
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暨南大学学报（自然科学与医学版)
第37卷
2.2激光共聚焦显微镜观察自噬
激光共聚焦图片（图2)可见诱导组荧光细胞数 目明显多于对照组.对照组、诱导组分别取4个高倍 视野对荧光细胞数，荧光颗粒数，含有荧光颗粒的细
胞数计数(表1).可发现诱导组绿色、红色荧光细胞 数，荧光颗粒数，含有荧光颗粒的细胞数大于正常对
照组<〇. 05).证明在Ecal 09细胞中已经建立自 噬模型.
A1 :转染了 mcherry-GFP-LC3质粒的对照绀敁小绿色炎光;A2:转染了 mcheny-GFP-LC3质粒的对照组显示红色炎光;A3:转染了 mcherry-GFP-
LC3质粒的对照纟丨以承红绿荧光稃加；B1 :转染了 mCherry-GFP-LC3质粒的诱导绀绿色荧光;转染了 mCherry-GFP-LC3质粒的B2:诱导组红色荧 光;B3 :转染了 mC herry-GFP-LC3质粒的诱导组红绿突光叠加
A l. Representative fluorescent images of Ecal09 cells transiently transfected with mcherry-GFP-LC3 without treatment, which has been shown green fluore- sescence. A2. Representative fluorescent images of Eqal09 cells transiently transfected with mcherry-GFP-LC3 without treatment, which has been shown red fluoresescenc©* A3, fluoresescence image colocalization of mcherry-GFP-LC3 without treatment. Bl. Representative fluorescent images of Ecal09 cells transiently transfected with mcherry-GFP-LC3 induced with rapamycin, which has been shown green fluoresescence. B2. Representative fluorescent images of Ecal09 cells transiently transfected with mcherry-GFP-LC3 induced with rapamycin, which has been shown red fluoresescence. B3. fluoresescence im­age colocalization of mcherry-GFP-LC3 with rapamycintreatment.
图2
激光共聚焦图片（x400)
Fig. 2 fluoresescence images by confocal microscope ( x400)
表1对照组和诱导组荧光细胞，荧光颗粒，含有荧光颗粒的细胞数目比较
Table 1 The number comparisons of fluorescence cells, fluorescence particals and cells contained fluorescence particles be­
tween the groups of control and induction
组别荧光细胞数均数U
荧光颗粒数均数2)含有荧光颗粒的细胞数均数3)71
绿色红色
绿色
红色
绿色
红色
对照组
410.25
3.500.25 6.75 2.4%6
4.3%
诱导组
4
17.25
20.25
12.5050.2523.2%40.7%1) /h 绿也X 光的细胞中，对炎光细胞数进行计数统计，对照组$ = 2. 981，诱导组s = 4. 272.对照绀诱导组比较，i = 2. 686，尸=0. 036;在红色 突光的细胞中，对突光细胞数进行计数统计，对照组s =2. 982,诱导组s =3. 775.诱导绀对照绀4诱1^组比较，i =7. 771，尸=0;2) 在含有绿色荧光颗粒的绿也炎光细胞中，对荧光颗粒进行I 卜数统计，对照组s = 〇. 5，诱导组s = 7. 141，对照组与诱导组比较j = 3. 422， P =0.014;在含有红色荧光颗粒的红色費光细胞中，对荧光颗粒进行1丨•数统汁，对照到U = 8. 342,诱咩组s = 14. 728诱咩绀照飢4诱啐绀比较，i =5. 14，P=0.02.
3) 在含有绿色突光颗粒的绿色突光细胞中，对禽打突光颗粒的突光细胞数计数统计，对照组s =0. 5.诱导组s =0. 817.对照组与诱导组比较， ^7. 833，P =0;/i K /红也荧光颗粒的红笆炎光细胞屮，对禽打红也荧光颗粒的红笆荧光细胞进行计数统计对照组s = 1. 893.诱导组= 2. 217诱导飢对照组与诱异组比较，《
=4. 116,P =0. 06.
第6期李晓苗，等:Ecal09细胞中自噬模型的建立495
所有数据应用SPSS 17. 0统计学软件进行f检 验，P< 0.05,有统计学差异.
3讨论
细胞自嗟是存在于真核生物中重要的生命现 象，广泛参与到多种生理和病理过程中.肿瘤细胞中 存在着自嗟的改变.自嗟可以清除细胞器避免氧自 由基蓄积发生突变[9].在人类乳腺癌、卵巢癌中，Be-clin-1基因缺失比例较高[1°].Marino等™研究发现，敲除ATG4的小鼠其纤维肉瘤的发生率比野生 型小鼠明显增高，且发生的时间也提前.自嗟又有减 少DNA损伤，保持基因组完整的功能.在永生化鼠 肾上皮细胞中自嗟活性降低可致细胞DNA损伤，基 因扩增，提高肿瘤的发生率[12].在肿瘤形成的最初 阶段，若自嗟功能缺陷，会导致受损细胞积累、毒性 蛋白积聚、活性氧产生、代谢平衡破坏，引起基因组 损伤和染色体异常，而导致癌变[13].在肿瘤形成后，肿瘤细胞的生长需要自嗟提供新陈代谢所需要的物 质和能量进行增殖.而且在血管形成之前，肿瘤细胞 通常需要在缺氧的环境下进行生存，自嗟可以在缺 氧环境下吞嗟损伤的线粒体，维持肿瘤细胞存活[14].有研究者使用乙型肝炎病毒蛋白转染人肝癌 细胞，可上调细胞自嗟的水平，提示自嗟在病毒感染 所致的肝癌中也发挥着重要的作用[15].目前，已经 从酵母中鉴定出多种与自嗟相关的特异性基因，并 统一命名为自噬相关基因（autophagy related gene，a t g).他们编码的蛋白在自噬发展的各个阶段都有 重要作用[16].在自噬的诱导阶段，经典的诱导途径 是通过哺乳动物雷帕霉素革E蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR)与 UNC-51 样酶（UNC-51 like kinase 1，ULK1)复合物之间的作用来实现的.自嗟 得以诱导后，由mVpS34复合物Atg4-VpS34复合物 Atgl4-Vps15-mVps34启动膜泡的成核反应，并使自 嗟蛋白Atg21、Atg24结合到膜上，形成前自嗟体(pre-autophagosomal structure，PAS)[17].自嗟前体形 成后，膜泡扩张并将底物包绕，形成自嗟体.自嗟体 形成涉及2种泛素化系统，分别是Atgl2-Atg5和 LC3-II(酵母Atg8的同系物）-磷脂酰乙醇胺（沖〇8-phatidylethanolamine，PE)复合系统.在自嗟体成熟 降解阶段，自嗟体通过微管骨架运输到溶酶体，其外 膜与溶酶体融合，内容物被水解酶降解.但该阶段的 分子调控机制仍不清楚.
范涛等[18]将PAsGreen2-N l-LC3质粒应用转染 技术将该质粒导入大鼠肺泡巨嗟细胞（NR8383)，筛选并获得稳定表达的细胞株.可对活细胞内自嗟过 程进行有效动态检测.加入雷帕霉素有效诱导自嗟，经荧光显微镜观察，RT-PCR及Western blot等方法 证实成功构建了肺泡巨嗟细胞自嗟模型.本研究通 过在Ecal09食管鳞癌细胞中加入雷帕霉素建立自 嗟模型，建立pmC herry-GFP-LC3稳定表达细胞株动 态检测细胞内的自嗟过程.通过激光共聚焦显微镜 观察，可发现诱导组绿色、红色荧光细胞数，荧光颗 粒数，含有荧光颗粒的细胞数大于正常对照组（P< 0.05)，表明雷帕霉素诱导自嗟有效，在Ecal09细胞 中建立了自嗟模型.Ecal09细胞中自嗟模型的建 立，这将为研究溶酶体与自嗟体融合阶段的发生、发 展及其分子调控机制提供了平台.
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[责任编辑:刘蔚绥]
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[责任编辑：陈咏梅]。