T淋巴细胞亚群、VEGF、MMP-14检测对肝癌射频消融术后残癌临床评估的价值

国际医药卫生导报2019年第25卷第8期IMHGN,April2019,Vol.25No.8
T淋巴细胞亚群、VEGF、MMP-14检测对肝癌射频消融术后残癌临床评估的价值
霍传红张淑红
德州市人民医院253014
通信作者：霍传红，Email:dr_wangss@
【摘要】目的检测原发性肝癌(HCC)患者采用射频消融术(RFA)后，组织内T淋巴细胞亚群、血管内皮生长因子(VEGF)、金属蛋目酶-14(MMP-14)水平，分析以上指标对残癌的临床评估价值。

方法选取2017年11月至2018年10月间在本院行RFA手术的HCC患者60例作为观察组，均经肝穿刺病理活检确诊，收集观察组RFA术后32例非残癌组织(观察A组)及28例残癌组织(观察B组)；收集同期在本院行单纯手术切除的40例HCC组织标本作为对照组采用流式细胞仪检测两组患者外周血CD3+T细胞、CD4+T细胞、CD4+/CD8+细胞；采用免疫组化法检测VEGF及MMP-14阳性表达。

结果治疗后，对照组和观察组外周血CD4+及CD4+/CD8+水平均显著低于治疗前,而CD8+则显著高于治疗前(P <0.01)；治疗后1个月,观察A组CD3+水平为(73.7士17.1)%、CD4+为(41.2土10.5)%、CD8+为(21.3±5.6)%、CD4+/CD8+为(2.0±0.6),均明显优于对照组及观察B组，组间差异均有统计学意义(P <0.05)。

治疗后，观察B组VEGF蛋白阳性人数为24例(85.7%),MMP-14蛋白阳性人数为22例(78.6%),均显著高于对照组及观察A组，组间差异均有统计学意义(P<0.05)结论RFA术后，HCC无残癌组织的T淋巴细胞亚群有明显升高，而残癌组织中VEGF及MMP-14蛋白水平较高，临床可以通过检测T淋巴细胞亚群、VEGF及MMP-14水平判断HCC是否存在残留病灶：
【关键词】淋巴细胞亚群；VEGF;射频消融术；MMP-14；原发性肝癌
基金项目：山东省医药卫生科技发展计划项目(2017WS541)
DOI：10.3760/<ma.j.issn.l007-1245.2019.0&003
Clinical evaluation of T lymphocyte subsets and VEGF,MMP-14in residual carcinoma after radiofrequency ablation of liver cancer
Huo Chuanhong,Zhang Shuhong
Dezhou People's Hospital,Dezhou253014,China
Corresponding author:Huo Chuanhong,Email:dr_wangss@
[Abstract]Objective To detect the levels of T lymphocyte subsets,vascular endothelial growth factor (VEGF),metalloproteinase-14(MMP-14)in patients with primary liver cancer(HCC)after radiofrequency ablation(RFA),to evaluate the clinical evaluation value of the above indexes in residual carcinoma.Methods From November2017to October2018,60HCC patients undergoing RFA operation in our hospital were selected as the observation group.All the patients were diagnosed by liver biopsy.32cases of non-residual carcinoma tissues(group A)and28cases of residual carcinoma tissues(group B)were collected after RFA operation in the observation group.A total of40HCC tissue specimens were collected as control group after simple surgical resection in our hospital during the same time period.CD3+T cells,CD4+T cells,CD4+/CD8+in the peripheral blood were detected by flow cytometry,and the positive expression of VEGF and MMP-14were detected by immunohistochemical method.Results After treatment,the levels of CD4+and CD4+/CD8+in the control group and the observation group were significantly lower than those before treatment,while CD8+was significantly higher than that before treatment(P<0.01).One month after treatment,the levels of CD3+,CD4+,CD8+,and CD4+/CD8+in group A were(73.7±17」)％,(41.2±10.5)%,(21.3±5.6)%,and(2.0±0.6),respectively,which were significantly better than those in the control group and group B,with statistically significant differences among the three groups(P<0.05).After treatment,24cases(85.7%)were positive for VEGF protein and22cases(78.6%) were positive for MMP-14protein in group B,which were significantly higher than those in group A and the control group,with statistically significant differences(P<0.05).Conclusion After RFA,the T lymphocyte subsets of HCC without residual carcinoma were significantly higher,while the levels of VEGF and MMP-14protein
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were higher in residual carcinoma tissues.It may be possible to determine the presence of residual lesions in HCC
by detecting T lymphocyte subsets,VEGF,and MMP-14levels in clinic.
[Key words]Lymphocyte subsets;Vascular endothelial growth factor(VEGF);Radiofrequency ablation
(RFA);MMP-14;Primary liver cancer
Fund program:Medicine and Health Science and Technology Development Project of Shandong Province
(2017WS541)
DOI：10.3760/cma.j.issn.1007-1245.2019.08.003
原发性肝癌（HCC）是一种致死率较高的恶性肿瘤，射频消融术（RFA）是目前临床治疗小HCC 的常用方法，具有操作简便、疗效确切的特点"役近年来研究发现：RFA术后可能会引起病灶残留及HCC复发，影响患者预后因此，及早诊治残癌对于改善患者预后具有重要作用。

基于此，本研究通过观察HCC患者RFA术前后T淋巴细胞亚群、金属蛋白酶-14（MMP-14）及血管内皮生长因子（VEGF）水平变化，以期为临床寻找出评估残癌的有效指标，现将研究结果报道如下。

1资料与方法
1.1一般资料选取2017年11月至2018年10月在本院行RFA手术的HCC患者作为观察组，均经肝穿刺病理活检确诊，收集观察组RFA术后32例非残癌组织（观察A组）及28例残癌组织（观察B组）。

收集同期在本院行单纯手术（对照组）切除的40例HCC组织标本。

纳入标准：①近期未接受过HCC相关治疗者；②观察组癌灶W3个，每个病灶W5cm；
③未合并免疫系统疾病者。

排除标准：①存在严重心、脑、肾疾病者；②糖尿病或病毒性肝炎感染病史者；
③存在RFA治疗禁忌证者。

本研究已经医院伦理委员会审批通过，患者均已签署知情同意书。

1.2治疗方法对照组进行HCC手术治疗。

观察组在B超引导下，确认肿瘤位置及进针方向。

采用肿瘤射频消融射频治疗仪（上海迈德医疗科技公司），主频460kHz,输出功率连续可调，主机自动测试完成后配套使用韩国RF Medical Co,Ltd,若病灶直径&3cm,需行多次反复穿刺消融，以灭活病灶。

每次治疗的消融位点需W3个，消融结束后进行针道消融。

术后通过CT或MRI平扫判断消融效果及残癌组织的变化1510
1.3观察指标记录两组患者性别、年龄、甲胎蛋白（AFP）及肿瘤直径，记录3组患者治疗前及治疗后1个月的VEGF、MMP-14、T淋巴细胞亚群（CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+）水平。

1.4检测方法（1）T淋巴细胞亚群：采用美国BECKMANCOULTER公司Epics XL型流式细胞仪检测两组癌组织中浸润T淋巴细胞亚群，计算出CD3+、CD4+、CD8+及CD4+/CD8+的相对含量，从而得出各细胞群的相对比值。

（2）免疫组化法：石蜡包埋组织，4呵切片，采用鼠抗人VEGF和鼠抗人MMP-14单克隆抗体，购自公司，已知的阳性为阳性对照，PBS为阴性对照，显微镜下随机选取阳性染色度最强的5个视野进行评分，并计算阳性细胞百分比。

染色强度评分如下：细胞质中无染色：0分，淡黄色：1分，黄棕色：2分，棕褐色：3分。

阳性细胞数：W25%计I分，26%~50%计2分，51%~75%计3分，>75%计4分。

两者相加为总得分，得分N4分则为VEGF和MMP-14阳性［6,0（3）AFP：采用日立7600-110自动生化分析仪检测肝功能指标，采用ELISA法检测AFP,试剂盒购自上海科华生物工程有限公司，严格按照试剂盒说明书执行操作。

1.5统计学分析采用软件SPSS2
2.0处理数据，以”（％）表示计数资料行*2检验；以（F土S）表示计量资料，行独立t检验，对于不符合正态分布的数据采用秩和检验.以P<0.05为差异有统计学意义。

2结果
2.1两组一般资料比较两组间一般资料差异无统计学意义（P>0.05），详见表1。

表1两组一般资料比较
组别例数男/女年龄（岁）AFP（pg/L）肿瘤直径（cm）伴有肝硬化（例）观察组6037/2355.8±10.7647.6±142.3 4.8±1.246
对照组4024/1653.2±10.9639.5±137.7 5.1±1.331
Zlx'lt值P值0.028
0.867
1.1820.282
0.2400.778
1.185
0.239
0.009
0.923
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2.2治疗前后癌组织中T淋巴细胞亚群比较治疗后，对照组和观察B组CD4+及CD4+/CD8+水平均显著低于治疗前，而CD8+则显著高于治疗前(P<0.01):治疗后，观察A组CD3+、CD4+、CI)8+、CD4+/CD8+水平均较治疗前、对照组及观察B组有明显改善(P<0.05)；详见表2。

2.33组癌组织中VEGF及MMP-14的免疫组化结果治疗后，观察B组VEGF及MMP-14蛋白阳性人数均显著高于对照组及观察A组(P<0.05),详见表3。

3讨论
HCC是一种发病率及致死率均较高的恶性肿瘤，目前，临床治疗HCC的方法有手术治疗、RFA及肝动脉化疗栓塞治疗等，而RFA是根治性治疗小HCC 的常用方法。

机体免疫力降低易引发HCC复发及转移，HCC外周血CD4+、CD8+T细胞P-STAT3表达上调，可能导致免疫监视异常，从而影响HCC的发病“役近年来研究指出：RFA不仅能够杀死肿瘤细胞，还能改善机体抗肿瘤免疫功能冋。

T淋巴细胞是肿瘤免疫的重要环节，可以和NK细胞同时在肿瘤免疫中发挥作用问。

有研究发现HCC细胞增殖时，患者免疫功能CD4+细胞、CD4+/CD8+及NK细胞发生了明显的变化"I MMP-14是MMPs家族中的一员，除了可以降解细胞外基质蛋白，破坏肿瘤细胞浸润屏障外，MMP-14还能调节VEGF的表达，起到促肿瘤血管生成的作用2^1VEGF属于促血管生长因子，可在病变的肿瘤组织中呈高表达状态，具有诱导行成新生血管、促进肿瘤生长的作用，还可为肿瘤转移提供有利环境冋，研究表明：血清VE(；F含量与HCC患者临床分期有关，参与了肿瘤的发生发展过程佝。

本研究结果显示：与治疗前比，观察A组经过RFA治疗后的CD3+、CD4+、CD4+/CD8+细胞上升,显著高于观察B组及对照组，CD8+细胞则明显下降.显著低于观察B组及对照组.而观察B组及对照组治疗后CD4+/CD8+反而明显降低(P<0.01)。

国内研究⑷也曾指出：RFA术后HCC患者的免疫功能得到了明显提高，提示经过RFA治疗后，机体细胞抗肿瘤免疫功能得到明显改善，但残癌组及手术治疗组的抗肿瘤免疫功能则仍然受到明显抑制，T 淋巴细胞亚群变化可能对HCC残留病灶具有一定的预测价值；原因可能为：RFA是通过高温使得肿瘤组织发生固化坏死，达到杀死肿瘤并防止病灶转移的效果，并能活化抗原递呈细胞，提高机体抗肿瘤免疫功能|l7-'8,o但在RFA术后，易引起病灶残留，残癌组织的免疫功能仍然较差，易引起HCC复发。

本研究结果还显示：治疗后，观察B组VEGF及MMP-14蛋白阳性人数均显著高于对照组及观察A 组；国内研究旧也曾指出：与手术治疗相比.RFA 术后HCC病灶的复发风险更高。

这提示：RFA术后，残癌组织的肿瘤血管形成因子VEGF及MMP-14蛋白表达均高于手术组及RFA无病灶残留组。

原因可能为：RFA术后残癌组织中的VEGF及MMP-14并未受到抑制，更易通过MMP-14释放VEGF,形成新生肿瘤血管，完成血管内皮细胞的生长分化.引起HCC病灶的再次复发。

且RFA手术更适用于<5 cm的HCC患者，对于直径较大的HCC患者需行多点定位消融，也能达到杀死肿瘤细胞的目的。

综上所述，T淋巴细胞、MMP-14及VEGF水平
表23组治疗前后T淋巴细胞水平比较(x±s)
组别例数时间CD3+(%)CD4+(%)CD8+(%)CD4+/CD8+观察A组32治疗前61.2±16.432.9±7.225.6±8.71」±0.4
治疗后73.7±17.严41.2±10.5^21.3±5.6"" 2.0±0.6、"
观察B组28治疗前60.6±15.531.8±6.925.6±8.71」士0.4
治疗后58.3±12.726.3±6.T*32.0±9.6"0.8±0.3d 对照组40治疗前60.8±14.932.6±6.725.7±8.2 1.3±0.5
治疗后64.9±15.227.8±5.6'*31.1±9.4“0.9±0.4"
注：-与对照组治疗后比,P<0.05.'P<0.01；与观察B组治疗后比.P<0.01；'j本组治疗前比.A P<0.01
表33组癌组织中VEGF及MMP-14的免疫组化结果［“(％)|
组别例数VEGF MMP-14
阳性阴性阳性阴性观察A组3219(59.4)13(40.6)17(53」)15(46.9)
观察B组2824(85.7)4(14.3)22(78.6)6(21.4)
对照组4025(62.5)15(37.5)21(52.5)19(47.5)
”值 4.330 4.315
P值0.0370.038
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均对RFA后是否残留病灶具有一定的诊断价值，此外，临床还可将MMP-14及VEGF作为防治RFA术后HCC复发的治疗靶点，但本研究尚存不足，如研究样本较小，未随访观察残癌组生存与死亡患者体内各因子水平变化等，需行进一步的大样本研究证实。

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(收稿日期:2019-01-02)
(责任校对：吴相思)
我刊名列国家第一批认定学术期刊名单
2014年12月10日，中华人民共和国国家新闻出版广电总局第一批认定学术期刊名单正式公布，《国际医药卫生导报》名列其中，排序4640(排名不分先后)，详情参国家新闻出版广电总局网/news/1664/233978.shtml：
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