大鼠下颌骨成骨细胞对格列本脲的转运

大鼠下颌骨成骨细胞对格列本脲的转运
目的：研究下颌骨成骨细胞（MO）对格列本脲的跨膜转运，为种植体全身给药提供实验依据。

方法：将大鼠MO与含有格列本脲的磷酸盐缓冲液（PBS）共同孵育一定时间后，收集细胞，超声波破碎，用高效液相色谱(HPLC)法测定裂解液中的药物含量，用考马斯亮蓝法测定细胞蛋白总量。

用细胞内药物含量与细胞蛋白的比值作为观察药物转运量的检测指标。

结果：实验组MO内可测到格列本脲的存在。

结论：MO可以跨膜转运格列本脲进入细胞内，证实了人工种植牙给药的可行性。

[Abstract] Objective: To investigate transmembrane transport of glybenclamide by osteoblasts，verifying the feasibility of local drug delivery of the design of dental implant administration system.Methods:To incubate the rat MO with agent solutions，then after incubation for indicated times，the agent solutions were quickly removed. The cells were collected and were disrupted by ultrasonic wave. The lysate agent concentration was measured by high performance liquid chromatography (HPLC) and the cell total protein was measured by Bradford assay.Results:Glybenclamide could be measured in MO.Conclusion:Rat mandibular osteoblast can transport glybenclamide into cells，which proves the possibility of the dental implant administration system.
[Key words] Osteoblast; Biological transport; High performance liquid chromatography (HPLC); Glybenclamide; Rat
在糖尿病的药物治疗中，选择合适的药物种类以及给药方式一直受到大家的广泛关注。

为了减少全身用药的副作用，局部给药越来越多，刘洪臣[1]还提出了人工种植体给药系统的概念，即通过特殊设计的种植体与骨的接触，使药物进入牙周局部以及全身，这需要了解口腔各组织、牙槽骨组织对不同药物的转运能力。

本研究通过观察大鼠MO对格列本脲转运能力，为种植体全身给药提供实验依据。

1 材料与方法
1.1 材料
4~6周SD成年大鼠（军事医学科学院动物所提供）；格列本脲（Sigma，USA）；高效液相色谱仪（Agilent 1100LC色谱系统，紫外检测器）。

1.2 细胞培养
将4~6周SD成年大鼠颈椎脱臼法处死，置于75%酒精中浸泡5 min，在无菌条件下取出带有肌肉和筋膜的下颌骨，置于75%酒精中洗5~10 s后，在5.25%NaClO中浸泡1 min，用PBS(含200 U/ml 青霉素、200 μg/ml 链霉素)冲洗
3次，完全剥离肌肉和筋膜，拔除牙齿，将下颌骨用咬骨钳剪碎成2 mm × 2 mm 的骨片后，用PBS冲洗骨片，去除残余血液，加0.125%胰酶，在37℃消化8 min。

消化6次后终止，收集第2~5次消化液过滤并离心，去除上清后用含20%胎牛血清的H-DMEM（内含100 U/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素）重悬细胞，接种于培养瓶中在37℃、5%CO2、饱和湿度条件下于恒温孵箱中静置培养40 min，差速贴壁除去成纤维细胞，纯化成骨细胞后继续培养。

经酶消化后的組织块，再次剪碎至1 mm×1 mm，铺于培养瓶中倒置培养，待细胞长满传代。

传代时，差速贴壁40 min反复纯化成骨细胞。

第4~8代细胞用于实验。

1.3 样品制备
0.01 mol/L PBS快速洗涤细胞后，将100 μg/ml的格列本脲溶液分别加入细胞培养皿，置于37℃恒温孵箱中孵育1、3、5、10、15、20、30、45 min后倾去药液，0.01 mol/L PBS室温快速洗涤4次，吸干平皿中液体，加入0.01 mol/L PBS 1 ml后用细胞刮处理收集，得到细胞悬液2.0 ml。

细胞悬液置于5.0 ml的EP管中，在冰浴中超声（功率400 W、作用3 s、间隔4 s、30次循环）破碎细胞。

吸取1.0 ml液体，用于蛋白测量。

另外的1.0 ml液体高速离心，吸取上清，0.22 μm 孔径滤膜过滤，用于高效液相色谱测量。

1.4 色谱条件
分析柱Agilent Zorbax SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）。

以甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氢铵溶液[用磷酸调节pH值至(3.5±0.05)]（7∶3）作为流动相，流动相经过0.45 μm 微孔滤膜真空负压过滤、超声排气。

流速为1.0 ml/min，进样20 μl，检测波长为235 nm，柱温为室温。

1.5 蛋白测量
将新鲜配制的考马斯亮蓝染液3 ml与上述细胞裂解液300 μl混匀静置10 min，使用紫外分光光度计在595 nm测定吸光度，根据标准品浓度得到的标准曲线，计算样品蛋白质浓度[2]。

用细胞内药物含量与细胞蛋白的比值作为观察药物转运量的检测指标。

2 结果
2.1 格列本脲色谱学指标
标准品及实验样品主成分峰的保留时间约为5.2 min，进样峰未对主成分峰有影响，分离度良好（图1、2）。

阴性对照、空白对照在药物的保留时间附近均未出峰。

浓度在3.2~50.0 μg/ml范围内，线性关系良好，相关系数(r)为0.999 9。

以药物浓度（ng/ml）为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y），得回归方程Y=0.064 786 92X + 0.053 974 7。

最低检测限为0.5 ng(信噪比≥3)。

图2 格列本脲样品色谱图
2.2 高效液相色谱法检测细胞内格列本脲的含量
MO内可检测到格列本脲的存在，转运格列本脲的量与药物的孵育时间有关。

在0~10 min增加幅度较大，20 min后细胞内药量开始逐渐下降（图3）。

3 讨论
去除药物孵育液后，由于采用四次PBS快速洗涤培养皿，细胞外环境中已经没有药物成分。

Yang等[3]的研究也证实了这一点，所测得的药物浓度应为被细胞跨膜转运至细胞内的成分。

在本研究中，评价药物转运量的指标是细胞内药物含量与细胞蛋白的比值，这是研究物质转运动力学的常用参数之一[4]。

本实验发现，磺脲类降糖药格列本脲在MO中存在转运，且转运呈现时间依赖性。

在0~10 min内，药物转运总量上升很快。

10~20 min内基本保持稳定，20~45 min药物转运总量总体上表现为下降趋势。

成骨细胞可以跨膜转运格列本脲，药物的转运量和药物孵育时间有关。

证实了人工种植牙给药的可行性。

[参考文献]
[1]刘洪臣.人工种植牙全身给药系统的设计[J].口腔颌面修复学杂志，2006，7（4）：291-292.
[2]司徒镇强,吴军正.细胞培养[M].西安:世界图书出版公司,1996. 188- 189.
[3]Yang Q, Nakkula RJ, Walters JD. Accumulation of ciprofloxacin and minocycline by cultured human gingival fibroblasts[J]. J Dent Res, 2002, 81 (12): 836- 840.
[4]Brayton JJ, Yang Q, Nakkula RJ, et al. An in vitro model of ciprofloxacin and minocycline transport by oral epithelial cells[J]. J Periodontal, 2002, 73 (11): 1267- 1272.
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。