屎肠球菌R2培养条件优化及酸浆发酵剂的制备

上海仪电科学仪器股份有限公司;LRH_250_A生化培 养箱：广东泰宏君科学仪器股份有限公司;HZP-250 全温培养振荡器：上海精宏实验设备有限公司;TS200B台式空气浴恒温摇床:上海捷呈实验仪器有限公 司；JYC-21ES55C电磁炉:九阳股份有限公司；桨式搅 拌器:盐城市沃特机械设备有限公司;RMQYL立式油
2021年6月 第42卷第"期
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1.3.5屎肠球菌R2有氧呼吸增殖条件正交试验优化 根据单因素试验结果，选择温度、转速、血红素浓
结果表明，培养前6 h时,No Ox/No H与Ox/H两 种培养条件下菌种生长量无显著差异；培养12 h后，
度、初始pH值4个因素进行优化,以发酵液培养24 h 两者出现显著差异,Ox/H培养条件下的生物量显著高
的值为检测指标，进行D(3")正交试验设计，确
于No Ox/No H条件下的生物量，说明Ox/H培养条件
定最佳增殖条件,因素水平见表10
对屎肠球菌R2的生长没有产生迫害作用,反而有促
1.3.6发酵剂菌粉的制备 分别以传统发酵(No Ox/NoH)和最适有氧呼吸
进作用。PATRICK等卩嘶究表明，当血红素和氧气存 在时，乳球菌最初的生长是通过发酵代谢方式实现
生物工程
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DOI: 10.12161Zj.issn.1005-6521.2021.ll.026
屎肠球菌R2培养条件优化及 酸浆发酵剂的制备
陈志娜叫沈业桥1,叶韬",黄琳] (1.淮南师范学院生物工程学院，安徽淮南232038； 2.资源与环境生物技术安徽普通高校重点实验室，
道内的pH值，可以维持和调节动物肠道菌群生态平 衡叫特别是在幼龄动物肠道保健和疾病的防疫以 及治疗上有突出表现。屎肠球菌广泛存在于传统乳制 品已、泡菜叫豆酱同、香肠E等发酵食品中，可以影响食 品的香气、风味、质地，还能产生多种有益成分叽课题 组前期从泡菜中筛选出一株可用于酸浆发酵的屎肠
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(Ox/H)条件对屎肠球菌R2进行培养,24 h后取菌液 置于离心管中，以转速5 000 r/min离心10 min后，弃 去上清液,加适量生理盐水溶解菌泥,添加冷冻保护
的，在培养8 h之后才将代谢方式转换为有氧呼吸代 谢,生物量继续增加，可能细胞对血红素的摄取等因 素限制了对数前期细胞血红色素的活性。
剂(谷氨酸钠5%、脱月旨乳10%、蔗糖10%)叫于-80 °C 下过夜冷冻;取冻结菌泥放于真空冷冻干燥机中进
行干燥,24h后完全干燥成菌粉状态，获得纯种酸浆 发酵剂。
乳酸细菌培养基（MRS）：蛋白腺10.0 g、牛肉膏 10.0 g、酵母膏5.0 g、葡萄糖20.0 g、磷酸氢二钾2.0 g、 乙酸钠5.0 g、硫酸猛0.25 g、硫酸镁0.58 g、柠檬酸二鞍 2.0 g、吐温-80 1.0 mL、蒸憎水 1 L,pH 6.2,121 七下灭 菌20 min。MRS固体培养基再添加琼脂粉18.0 g,用于 培养计数。
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食品硏究与开发
生物工程
球菌E.faecium R2叫对其进行了安全性评价㈣，证明 了其实用性与安全性，可用于酸浆发酵剂的制备，具 有广阔的应用前景。活菌数量是衡量发酵剂性能的主 要指标,研究表明相对于厌氧发酵,乳酸菌利用有氧 增殖可显著提高菌体数量，减少发酵剂生产成本。另 外,进行有氧代谢的乳酸菌的长期存活能力是发酵代
Huainan 232038, Anhui, China ) Abstract: The purpose of this study was to optimize the conditions for preparation of high-activity Enterococcus faecium R2 acid pulp starters. After verifying aerobic respiration, optimization of aerobic respiration by single factor and orthogonal tests of temperature, heme concentration, initial pH, and rotation speed was performed by measuring optical density at 600 nm. The quality of acid pulp starters prepared by freeze-drying was then evalu­ ated. The optimal proliferation conditions for E. faecium R2 undergoing aerobic respiration were： temperature, 32 °C; rotation speed, 175 r/min; heme concentration, 3.0 |ig/mL,and initial pH 5.9. The number of viable bacte­ ria in acid pulp starters cultivated with aerobic respiration reached 1.33 xlO9 CFU/g. Its acid production was good, and could be used in the processing of acid pulp.
表1正交试验因素水平 Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment
水平 A
温度代
1
32
2
37
3
42
B 转速/(r/min)
125 150 175
因素
C
D
血红素浓度/（Mg/mL ）初始pH值
1.0
5.6
2.0
5.9
3.0
6.2
生物工程
貪品研究与开发
1.2设备和仪器 JA2203N电子天平：上海民桥精密科学仪器有限
公司；UV2300紫外可见分光光度计:上海天美科学仪 器有限公司;ZHWY-100B恒温振荡培养箱:上海智诚 分析仪器制造厂;LDZF-30KB立式压力蒸汽灭菌器: 上海申安医疗器械;SW-CJ-2D双人单面垂直净化工 作台：苏州博莱尔净化设备有限公司;pHS-3CpH计:
呼吸代谢2即。因此,本文以E.faecium R2为研究对 象,验证该菌株是否可进行有氧呼吸代谢,进而采用 单因素和正交试验设计对其有氧呼吸增殖条件进行 优化,获得纯种酸浆发酵剂，并对该发酵剂的发酵性 能进行评价,以期为酸浆发酵剂的推广和大豆黄浆水 的开发利用提供理论依据和试验基础。
将屎肠球菌R2接种到MRS培养基中，于37 P下 静置培养14 h,备用。 1.3.2黄浆水的制备
凝固剂的影响。
1.3.3屎肠球菌R2在传统发酵与有氧呼吸条件下的 生长趋势
0.5 mg/mL血红素溶液:称取0.05 g血红素,将其 溶于0.05 moVL的NaOH水溶液中,4七下于棕色广口 瓶中保存备用。
将活化后的屎肠球菌R2按3%的接种量分别接 种到黄浆水培养基与黄浆水血红素培养基中,分别在 传统发酵（无氧无血红素:静置培养，黄浆水培养基,用
Optimizing Culture Conditions of Enterococcus faecium R2 for Preparation of Acid Pulp Starters CHEN Zhi-naU2,SHEN Ye-qiao^YE Tao12, HUANG Lin1
(1. College of Biological Engineering, Huainan Normal University, Huainan 232038, Anhui, China; 2. Key Laboratory of Bioresource and Environmental Biotechnology of Anhui Higher Education Institutes,
取30 mL黄浆水加入到250 mL锥形瓶中,为黄浆 水培养基，在此基础上添加60 |jlL 0.5 mg/mL的血红素 溶液，即得黄浆水血红素培养基,121 P下灭菌20 min, 备用。
No Ox/No H表示）、有氧呼吸（有氧有血红素:150 r/min摇 床培养，黄浆水血红素培养基,用Ox/H表示）2种条 件下于37七下培养24 h,于6,12,24 h测定菌种
安徽淮南232038)
摘 要：为制备高活性屎肠球菌R2纯种酸浆发酵剂，首先对屎肠球菌R2的有氧呼吸代谢进行验证,随后以600 nm 下的光密度值为测定指标对屎肠球菌R2有氧呼吸增殖的培养温度、血红素浓度、初始pH值、摇床转速进行四因素 三水平单因素和正交试验优化，获得该菌株有氧呼吸最佳增殖条件;在此基础上采用冷冻干燥制备酸浆发酵剂，并对 发酵剂的品质进行评价。结果表明，屎肠球菌R2有氧呼吸最佳增殖条件为，温度32花,转速175 r/min,血红素浓度 3.0 |JLg/mL,初始pH 5.9;采用有氧呼吸增殖得到的酸浆发酵剂活菌数为1.33xl09CFU/g,且其产酸性能良好，可用于酸 浆的加工。 关键词:屎肠球菌;有氧呼吸;正交试验;优化;酸浆发酵剂
谢的106倍~108倍，可延长发酵剂的货架期叩。因此, 通过有氧代谢方式来提高乳酸菌细胞数量,为规模化
压千斤顶:荣美液压机械制造有限公司;FD-1A-5O台 式真空冷冻干燥机:北京博医康实验仪器有限公司。
发酵剂制备工艺提供新的思踏現 研究表明添加外源血红素可使肠球菌进行有氧
1.3方法 1.3.1菌种活化
豆腐模具中于5.5 kPa~6.0 kPa压力下压浆30 min,得
屎肠球菌｛E.faecium R2）CGMCC 14944：中国普 通微生物菌种保藏管理中心;脱脂乳粉：内蒙古伊利
到黄浆水％试验用酸浆参考叶青等U啲方法采用三级 豆腐黄腐黄浆水为发酵基质制备而成,以消除原卤盐
实业集团股份有限公司;1-谷氨酸钠盐、氯化血红素: 上海麦克林生化科技有限公司;蛋白豚、葡萄糖、牛肉 膏、蔗糖:国药集团化学试剂有限公司。
取700 g黄豆用蒸憎水于25 T下浸泡8 h后，豆 水比l：8（g/mL）打浆,用100目尼龙筛布过滤除渣，所 得生豆浆煮沸并维持5 min,当降温至85七时,轻轻搅

动下缓缓加入酸浆，直至出现均匀脑花，添加量为16%
1材料与方法
（质量分数）左右。85 P下蹲脑20 min后，将豆花倒入
1.1材料与试剂
Key words： Enterococcus faecium;aerobic respiration;orthogonal experiment;optimization;acid pulp starters
引文格式： 陈志娜，沈业桥，叶韬,等.屎肠球菌R2培养条件优化及酸浆发酵剂的制备[J].食品研究与开发,2021,42(11)： 161-166. CHEN Zhina, SHEN Yeqiao, YE Tao, et al. Optimizing Culture Conditions of Enterococcus faecium R2 for Preparation of Acid Pulp Starters[J]. Food Research and Development, 2021, 42( 11)： 161-166.
屎肠球菌(Enterococcus faecium )属于乳酸菌的一k 种，因为在代谢过程中产生乙酸和乳酸,能够降低肠
基金项目:安徽省自然科学基金青年项目(1908085QC122)；淮南市 科技计划项目(2018A365) 作者简介:陈志娜(1988—),女(汉)，畐燉授，博士，研究方向:食晶生 物技术。
值。
1.3.4屎肠球菌R2有氧呼吸增殖条件单因素优化 将活化后的屎肠球菌R2按3%接种量接入黄浆
水血红素培养基，通过测定ORoo值来比较不同温度 （32、37、42 T）、转速（125,150,175 r/min）、血红素浓度 （1.0、2.0、3.0 ixg/mL）、初始 pH（5.6、5.9、6.2）对其增殖 效果的影响。