microRNA-223-3p通过抑制LIF的表达和胞饮突的形成调控胚胎植入的机制研究

microRNA-223-3p通过抑制LIF的表达和胞饮突的形成调控胚胎
植入的机制研究
第一部分microRNA-223-3p和LIF在人类子宫内膜组织中表达水平的检测目的：检测内分泌功能正常、月经周期规则的女性的增生期、分泌中期子宫内膜组织中的microRNA-223-3p (miRNA223)和LIF的表达情况,探索miRNA223和LIF 是否参与对胚胎植入的调控。

方法：采用Real-time PCR (RT-PCR)的方法检测增生期、分泌中期的人类子宫内膜组织中miRNA223和LIF mRNA的表达情况。

采用免疫组化(IHC)的方法检测增生期、分泌中期的人类子宫内膜组织中LIF蛋白的表达情况和细胞定位。

结果：RT-PCR的结果显示,miRNA223在增生期子宫内膜组织中的表达水平显著高于分泌中期,而LIF mRNA在增生期子宫内膜组织中的表达水平显著低于分泌中期;IHC的结果显示,LIF蛋白在分泌中期子宫内膜组织中的表达水平显著高于增生期。

LIF蛋白在分泌中期子宫内膜的腔、腺上皮细胞中高度表达,在基质细胞中亦有表达。

结论：miRNA223和LIF在人类子宫内膜组织中的表达存在一定的时间、空间依赖性规律,该结果提示miRNA223和LIF可能参与对胚胎植入的调控,在胚胎植入过程中发挥重要作用。

miRNA223和LIF的表达水平存在一定的负性相关性,该结果提示miRNA223和LIF在围着床期可能存在相互作用关系。

以上结果尚需动物实验、细胞实验进一步验证。

第二部分microRNA-223-3p通过调节LIF的表达和胞饮突的形成抑制小鼠胚胎植入目的：检测孕、非孕小鼠子宫内膜组织中miRNA223、LIF的表达情况。

探索miRNA223是否通过抑制LIF的表达和胞饮突的形成进而影响胚胎植入。

方法：采用RT-PCR的方法对孕、非孕小鼠子宫内膜组织中miRNA223、LIF mRNA的表达进行检测。

采用Western Blot的方法对孕、非孕小鼠子宫内膜组织中的LIF蛋白进行检测。

孕第3天上午使用miRNA223激动剂(miRNA223-Agomir)对孕小鼠进行单侧宫角注射,孕第4天下午牺牲小鼠,采用RT-PCR的方法检测miRNA223、LIF mRNA 的表达情况：采用IHC的方法检测LIF、VEGF、CD34蛋白的表达情况：采用透射电镜的方法检测小鼠子宫内膜胞饮突的形成情况。

孕第9天上午牺牲小鼠,解剖并进行植入胚胎计数。

结果：孕小鼠子宫内膜组织中的miRNA223表达水平显著低于非孕小鼠,而LIF mRNA及蛋白的表达水平显著高于非孕小鼠。

宫角注射miRNA223-Agomir后,注射侧的miRNA223表达水平显著高于注射对侧,而注射侧LIF蛋白的表达水平显著低于注射对侧。

电镜结果显示,注射侧的小鼠子宫内膜中胞饮突形成显著受损。

注射侧植入胚胎数显著低于注射对侧。

结论：小鼠子宫内膜组织中miRNA223、LIF的表达规律与人类类似。

miRNA223可以抑制胚胎植入,该效应可能是通过下调LIF蛋白的表达水平和阻碍胞饮突的形成而实现的。

miRNA223是否直接作用于LIF并发挥生物学作用,LIF具体通过何种机制影响胞饮突,尚需进一步的研究。

第三部分microRNA223-3p通过直接抑制LIF的表达干扰子宫内膜上皮细胞骨架目的：验证miRNA223对LIF的调控作用是否属于直接作用；胞饮突是围着床期子宫内膜腔上皮细胞发生形变的产物,探索miRNA223是否通过下调LIF蛋白的表达水平影响子宫内膜上皮细胞的细胞骨架
而损害胞饮突的形成。

方法：使用miRNA223过表达克隆和LIF3’ UTR端靶标克隆转染293T细胞并进行荧光素酶检测。

使用miRNA223前体克隆对体外培养的子宫内膜上皮细胞来源的HES、RL95-2细胞系进行过表达干预,采用细胞免疫荧光化学(ICC)的方法检测鬼笔环肽和β-Tublin以观察子宫内膜上皮细胞骨架的情况。

结果：荧光素酶结果显示,miRNA223与LIF之间的作用属于直接作用关系。

经miRNA223前体克隆过表达干预后,miRNA223的表达水平显著升高,而LIF蛋白的表达水平显著下降。

过表达干预后的HES、RL95-2细胞均表现出不同程度的细胞骨架受损,其中HES细胞的鬼笔环肽和β-Tublin表达水平均降低；而RL95-2细胞的鬼笔环肽表达水平下降,但是β-Tublin无显著变化。

结论：miRNA223可以直接作用于LIF 并抑制LIF蛋白的表达,进而使子宫内膜上皮细胞骨架受损。

miRNA223通过LIF干扰子宫内膜上皮细胞的细胞骨架,可能是导致子宫内膜上皮细胞胞饮突形成受损的原因。