一种检测PML-RARA融合基因的LAMP引物组、试剂盒及检测方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202010873486.5
(22)申请日 2020.08.26
(71)申请人 苏州卫生职业技术学院
地址 215009 江苏省苏州市高新区科华路
28号
(72)发明人 刘松柏　
(74)专利代理机构 南京业腾知识产权代理事务
所(特殊普通合伙) 32321
代理人 李静
(51)Int.Cl.
C12Q 1/6886(2018.01)
C12Q 1/6844(2018.01)
C12N 15/11(2006.01)
(54)发明名称
一种检测PML-RARA融合基因的LAMP引物组、
试剂盒及检测方法
(57)摘要
本发明涉及一种检测PML ‑RARA融合基因的
LAMP引物组、试剂盒和检测方法，所述引物组包
括检测bcr1基因的LAMP引物组、检测bcr2基因的
LAMP引物组和检测bcr3基因的LAMP引物组，共17
条LAMP引物，序列如SEQ ID NO:1‑17所示。

检测
方法：以待测样本DNA为模板，采用上述检测bcr1
基因的LAMP引物组、检测bcr2基因的LAMP引物组
和检测bcr3基因的LAMP引物组进行环介导等温
扩增，然后对扩增产物进行检测，根据检测结果
进行判断。

本发明的检测方法能够快速、灵敏、特
异的检测出三种类型的PML ‑RARA融合基因，并且
操作简单，不需要复杂仪器，
检测成本低。

权利要求书3页 说明书6页序列表4页 附图1页CN 111850131 A 2020.10.30
C N 111850131
A
1.一种检测PML-RARA融合基因的LAMP引物组，其特征在于，包括检测bcr1基因的LAMP 引物组、检测bcr2基因的LAMP引物组和检测bcr3基因的LAMP引物组，
所述检测bcr1基因的LAMP引物组包括bcr1-F3引物、bcr1-B3引物、bcr1-FIP引物、bcr1-BIP引物、bcr1-LF引物和bcr1-LB引物，所述bcr1-F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述bcr1-B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述bcr1-FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述bcr1-BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述bcr1-LF 引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5，所述bcr1-LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；
所述检测bcr2基因的LAMP引物组包括bcr2-F3引物、bcr2-B3引物、bcr2-FIP引物、bcr2-BIP引物和bcr2-LF引物，所述bcr2-F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述bcr2-B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述bcr2-FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述bcr2-BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述bcr2-LF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11；
所述检测bcr3基因的LAMP引物组包括bcr3-F3引物、bcr3-B3引物、bcr3-FIP引物、bcr3-BIP引物、bcr3-LF引物和bcr3-LB引物，所述bcr3-F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示，所述bcr3-B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述bcr3-FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述bcr3-BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:165所示，所述bcr3-LF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16，所述bcr3-LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示。

2.一种检测PML-RARA融合基因的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述检测bcr1基因的LAMP引物组、检测bcr2基因的LAMP引物组和检测bcr3基因的LAMP引物组。

3.如权利要求2所述检测PML-RARA融合基因的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括2x反应缓冲液、荧光目视检测液和Bst DNA聚合酶。

4.一种检测PML-RARA融合基因的方法，其特征在于，以待测样本DNA为模板，采用权利要求1所述检测bcr1基因的LAMP引物组、检测bcr2基因的LAMP引物组和检测bcr3基因的LAMP引物组进行环介导等温扩增，得到扩增产物，对扩增产物进行检测，根据检测结果进行判断。

5.如权利要求4所述检测PML-RARA融合基因的方法，其特征在于，检测bcr1基因的反应体系为：
检测bcr2基因的反应体系为：
检测bcr3基因的反应体系为：
6.如权利要求4或5所述检测PML-RARA融合基因的方法，其特征在于，所述环介导等温扩增的反应条件为：63℃下恒温反应30min。

一种检测PML-RARA融合基因的LAMP引物组、试剂盒及检测
方法
技术领域
[0001]本发明属于生物技术领域，具体涉及一种检测PML-RARA融合基因的LAMP引物组、试剂盒和检测方法。

背景技术
[0002]急性髓系白血病(Acute myeloid leukemia,AML)是造血系统干细胞分化受阻引起的一类恶性肿瘤，其在国内及全球的发病数量与死亡数量均位居前列。

急性早幼粒细胞性白血病(Acute promyelocytic leukemia,APL)是AML的一个亚型，约占总AML患者数的10％-15％。

近年来APL患者确诊后通过及时服用全反式维甲酸及三氧化二砷药物，可达到90％以上的初期诱导缓解率，并可使70％以上的患者得到长期生存。

经研究发现，大约95％的APL患者存在t(15；17)染色体易位，造成PML基因与RARA基因融合在一起形成PML-RARA融合基因。

因此，PML-RARA融合基因目前是APL疾病诊断、疗效评价以及检测白血病微小残留状态的理想分子标志物。

[0003]根据PML基因断裂位置的不同，PML-RARA融合基因在APL患者中主要有三种亚型，即bcr1，bcr2及bcr3，分别称为长型(L型)，变异型(V型)和短型(S型)，在APL患者中发生的概率分别为55％，5％和40％。

[0004]目前检测PML-RARA融合基因的方法主要有荧光原位杂交法、荧光定量PCR法、基因芯片法、PCR测序法等。

然而，该类方法均存在设备依赖性、成本高、实验方法繁琐，时间长等缺点。

[0005]环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification,LAMP)方法自近年来被开发出来后，因其快速(15-60分钟)、简易(无需特殊设备)、灵敏、特异等特点近年来被广泛用于病毒、细菌等物种的鉴定工作，为物种大规模快速检测做出了巨大贡献。

发明内容
[0006]本发明的目的是解决现有技术中检测PML-RARA融合基因的方法存在的不足，提供一种检测PML-RARA融合基因的LAMP引物组、试剂盒及检测方法。

[0007]技术方案
[0008]一种检测PML-RARA融合基因的LAMP引物组，包括检测bcr1基因的LAMP引物组、检测bcr2基因的LAMP引物组和检测bcr3基因的LAMP引物组，
[0009]所述检测bcr1基因的LAMP引物组包括bcr1-F3引物、bcr1-B3引物、bcr1-FIP引物、bcr1-BIP引物、bcr1-LF引物和bcr1-LB引物，所述bcr1-F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 1所示，所述bcr1-B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，所述bcr1-FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，所述bcr1-BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示，所述bcr1-LF 引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:5，所述bcr1-LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示；[0010]所述检测bcr2基因的LAMP引物组包括bcr2-F3引物、bcr2-B3引物、bcr2-FIP引物、
bcr2-BIP引物和bcr2-LF引物，所述bcr2-F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述bcr2-B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示，所述bcr2-FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:9所示，所述bcr2-BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示，所述bcr2-LF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:11；
[0011]所述检测bcr3基因的LAMP引物组包括bcr3-F3引物、bcr3-B3引物、bcr3-FIP引物、bcr3-BIP引物、bcr3-LF引物和bcr3-LB引物，所述bcr3-F3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 12所示，所述bcr3-B3引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:13所示，所述bcr3-FIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:14所示，所述bcr3-BIP引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:165所示，所述bcr3-LF引物的核苷酸序列如SEQ ID NO:16，所述bcr3-LB引物的核苷酸序列如SEQ ID NO: 17所示。

[0012]一种检测PML-RARA融合基因的试剂盒，包括上述检测bcr1基因的LAMP引物组、检测bcr2基因的LAMP引物组和检测bcr3基因的LAMP引物组。

[0013]进一步，所述试剂盒还包括2x反应缓冲液、荧光目视检测液和Bst DNA聚合酶。

[0014]一种检测PML-RARA融合基因的方法：以待测样本DNA为模板，采用权利要求1所述检测bcr1基因的LAMP引物组、检测bcr2基因的LAMP引物组和检测bcr3基因的LAMP引物组进行环介导等温扩增，得到扩增产物，对扩增产物进行检测，根据检测结果进行判断。

[0015]进一步，检测bcr1基因的反应体系为：
[0016]
[0017]
[0018]检测bcr2基因的反应体系为：
[0019]
[0020]检测bcr3基因的反应体系为：
[0021]
[0022]进一步，所述环介导等温扩增的反应条件为：63℃下恒温反应30min。

[0023]本发明的有益效果：本发明提供了一种检测PML-RARA融合基因的LAMP引物组和试剂盒，能够快速(15-60min)、灵敏、特异的检测出三种类型的PML-RARA融合基因，并且操作简单，不需要复杂仪器，检测成本低。

附图说明
[0024]图1为不同拷贝数的PML-RARA融合基因序列PUC57质粒的检测结果；
[0025]图2为PML-RARA融合基因的特异性检测结果。

具体实施方式
[0026]下面结合附图和具体实施例对本发明的技术方案作进一步说明。

[0027]实施例1
[0028]利用bcr1(核苷酸序列如SEQ ID NO:18所示)、bcr2(核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示)、bcr3(核苷酸序列如SEQ ID NO:20所示)融合位点附近特异序列，设计检测PML-RARA 融合基因的LAMP引物组，包括检测bcr1基因的LAMP引物组、检测bcr2基因的LAMP引物组和检测bcr3基因的LAMP引物组，共设计17条LAMP引物，引物序列见表1。

引物序列送至金斯瑞有限公司合成，合成后稀释成10uM或20uM备用。

[0029]表1引物序列
[0030]
[0031]实施例2
[0032]一种检测PML-RARA融合基因的方法：以构建于PUC57载体的PML-RARA融合基因bcr1,bcr2,bcr3序列质粒(由江苏金斯瑞生物公司合成构建)为模板，采用实施例1表1所述检测bcr1基因的LAMP引物组、检测bcr2基因的LAMP引物组和检测bcr3基因的LAMP引物组进行环介导等温扩增，反应体系如下：
[0033]检测bcr1基因亚型的反应体系：
[0034]
[0035]检测bcr2基因亚型的反应体系：
[0036]
[0037]检测bcr3基因亚型的反应体系：
[0038]
[0039]上述反应体系中，BstDNA聚合酶及配套反应缓冲液，荧光目视检测试液均为荣研生物科技有限公司产品。

[0040]反应条件为：63℃恒温反应30min，于沸水中处理2min进行酶灭活处理，终止反应。

[0041]实施例3
[0042]灵敏度实验：
[0043]以构建于PUC57载体的PML-RARA融合基因bcr1,bcr2,bcr3序列质粒(由江苏金斯瑞生物公司合成构建)为模板，以10copy/uL的初始浓度使用超纯水进行10倍梯度稀释，稀
释成4个浓度梯度：102copy/uL，103copy/uL，104copy/uL，105copy/uL，以水代替模板作为阴性对照，按以下步骤进行检测：
[0044](1)按实施例2所述反应体系中自上而下的顺序往灭菌PCR管中进行加样，每个PCR 管的模板浓度分别为0、10copy/uL、102copy/uL，103copy/uL，104copy/uL，105copy/uL；[0045](2)轻轻用手指弹试管底部20次，使其充分混合，放入离心机离心数秒，使反应液沉到底部；
[0046](3)将配置好的反应试管置于水浴锅中，63℃下恒温反应30min，反应5min后手指轻弹试管底部，然后放回水浴锅继续反应；
[0047](4)将反应试管转移到沸水中2min进行酶灭活处理，终止反应；
[0048](5)将反应管拿出置于白光下进行肉眼观察，或者使用紫外线照射装置照射反应管底部进行颜色观察，绿色荧光为阳性结果。

[0049]图1为不同拷贝数的PML-RARA融合基因序列PUC57质粒的检测结果，从图1可以看出，当PML-RARA融合基因序列PUC57质粒为10copy/uL时，环介导等温扩增反应依然能进行，并且在白光下肉眼能观察到清晰的反应效果。

[0050]实施例4
[0051]特异性实验
[0052]以构建于PUC57载体的PML-RARA融合基因bcr1,bcr2,bcr3序列质粒(由江苏金斯瑞生物公司合成构建)为模板，浓度为102copy/uL，采用实施例2的反应体系进行环介导等温扩增检测，同时，分别用水、人类基因组DNA(人胚肾上批细胞293T细胞株提取基因组DNA)及PUC57空载质粒代替模板作为阴性对照，按照与实施例3相同的方法进行检测，检测结果见图2。

[0053]图2为PML-RARA融合基因的特异性检测结果。

可以看出，分别以水、人类基因组DNA 及PUC57空载质粒作为模板的阴性对照组颜色相同，而以浓度为102copy/uL的、构建于PUC57载体的PML-RARA融合基因bcr1,bcr2,bcr3序列质粒作为模板的实验组呈现出明显的颜色差别。

序列表
<110> 苏州卫生职业技术学院
<120> 一种检测PML-RARA融合基因的LAMP引物组、试剂盒及检测方法<160> 20
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 19
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 1
agccccgtca taggaagtg 19
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 2
tgaggacttg tcctgacaga c 21
<210> 3
<211> 38
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 3
ggtctcaatg gctgcctccc aggtcttcct gcccaaca 38
<210> 4
<211> 42
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 4
tctgaagaga tagtgcccag cccagcaagg cttgtagatg cg 42
<210> 5
<211> 18
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 5
ccactggcca cgtggttg 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 17
tcgccacccc ctctaccc 18
<210> 6
<211> 20
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 6
ccaatacaac gacagcccag 20
<210> 7
<211> 20
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 7
tcctgacaga caaagcaagg 20
<210> 8
<211> 40
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 8
cttgcctcct tcccctcctc aaagaggaag tgcagccaga 40 <210> 9
<211> 40
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 9
ccattgagac ccagagcagc atgtagatgc ggggtagagg 40 <210> 10
<211> 22
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 10
ccatcttgat gaccttcctg gg 22
<210> 11
<211> 18
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 11
tgcaggacct cagctctt 18
<210> 12
<211> 17
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 12
cttgcagccc tcacagg 17
<210> 13
<211> 38
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 13
agggagggct gggcactatc gcatcaccca ggggaaag 38
<210> 14
<211> 38
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 14
accccctcta ccccgcatag tggtagcctg aggacttg 38
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 15
gctgctctgg gtctcaatgg 20
<210> 16
<211> 22
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 16
ctacaagcct tgctttgtct gt 22
<210> 18
<211> 342
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 18
atggagtctg aggaggggaa ggaggcaagg ttggctcgga gctccccgga gcagcccagg 60 cccagcacct ccaaggcagt ctcaccaccc cacctggatg gaccgcctag ccccaggagc 120 cccgtcatag gaagtgaggt cttcctgccc aacagcaacc acgtggccag tggcgccggg 180 gaggcagcca ttgagaccca gagcagcagt tctgaagaga tagtgcccag ccctccctcg 240
ccaccccctc taccccgcat ctacaagcct tgctttgtct gtcaggacaa gtcctcaggc 300 taccactatg gggtcagcgc ctgtgagggc tgcaagggct tc 342
<210> 19
<211> 336
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 19
tatggctgtg gtacagtcag tgcccggggc acaccccgtg ccagtgtacg ccttctccat 60 caaaggccct tcctatggag aggatgtctc caatacaacg acagcccaga agaggaagtg 120 cagccagacc cagtgcccca ggaaggtcat caagatggag tctgaggagg ggaaggaggc 180 aagccattga gacccagagc agcagttctg aagagatagt gcccagccct ccctcgccac 240 cccctctacc ccgcatctac aagccttgct ttgtctgtca ggacaagtcc tcaggctacc 300 actatggggt cagcgcctgt gagggctgca agggct 336
<210> 20
<211> 256
<212> DNA
<213> PML-RARA融合基因(PML-RARA)
<400> 20
agcctgcaag ctgccgtgcg caccgatggc ttcgacgagt tcaaggtgcg cctgcaggac 60 ctcagctctt gcatcaccca ggggaaagcc attgagaccc agagcagcag ttctgaagag 120 atagtgccca gccctccctc gccaccccct ctaccccgca tctacaagcc ttgctttgtc 180 tgtcaggaca agtcctcagg ctaccactat ggggtcagcg cctgtgaggg ctgcaagggc 240 ttcttccgcc gcagca 256
图1图2
说　明　书　附　图1/1页CN 111850131 A。